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摘要
目的：研究SMAD家族成员1(SMAD family member 1,SMAD1)通过调控微RNA(microRNA,miRNA,miR)-32对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）细胞增殖、凋亡和迁移等生物学行为的影响，并探讨可能的作用机制。方法 ：实时荧光定量PCR法检测SMAD1在CRC细胞HCT-8、HCT-116和HT-29以及正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达水平。采用脂质体法分别将特异性针对SMAD1基因的si RNA(si SMAD1)和si RNA-阴性对照（negative control,NC）(si NC)转染至人CRC细胞HCT-116中，用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测沉默效果。分别采用CCK-8法、FCM法、划痕愈合实验和Transwell小室实验检测沉默SMAD1表达对细胞增殖、凋亡和迁移的影响；实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测沉默SMAD1表达对HCT-116细胞中mi R-32及其宿主基因TMEM245及靶基因PTEN表达的影响；实时荧光定量PCR法检测上皮-间质转化相关因子波形蛋白（Vimentin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）m RNA的表达水平。采用染色质免疫共沉淀法检测SMAD1是否能直接与TMEM245/mi R-32的启动子区相结合。分别将mi R-32-模拟物（mi R-32-mimics）以及阴性对照-模拟物（NC-mimics）转入HCT-116细胞，采用实时荧光定量PCR法检测转染效率和SMAD1的表达水平。分别同时共转染si SMAD1+mi R-32-mimics以及si SMAD1+NC-mimics至HCT-116细胞，采用CCK-8法、FCM法、划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测共转染后细胞增殖、凋亡和迁移能力的改变，实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染后对PTEN和上皮-间质转化相关因子表达的影响。结果 ：CRC细胞HCT-8、HCT-116和HT-29中SMAD1 m RNA的表达水平均高于正常结肠上皮细胞株NCM460细胞（P均<0.05）。si SMAD1转入HCT-116细胞后，HCT-116细胞中SMAD1 m RNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。沉默SMAD1基因表达后，HCT-116细胞的增殖和迁移能力均被抑制，而凋亡率明显增加（P均<0.05）,mi R-32和TMEM245m RNA的表达水平下调，PTENm RNA和蛋白表达水平上调（P均<0.05）,Vimentin和N-cadherin m RNA的表达下调，E-cadherin m RNA表达上调（P均<0.05）。染色质免疫共沉淀结果显示，SMAD1能与TMEM245/mi R-32核心启动子区相结合（P <0.05）。与si SMAD1+NC-mimics共转染组相比，si SMAD1+mi R-32-mimics共转染组细胞增殖、迁移能力增强，凋亡率减少，PTEN蛋白表达水平下调，Vimentin和N-cadherin m RNA的表达上调，E-cadherin m RNA表达下调（P均<0.05）。结论 ：沉默SMAD1表达可通过下调mi R-32表达来上调PTEN的表达水平，进而抑制CRC细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡。
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单位广东医科大学; 广东医科大学附属医院; 公共卫生学院
