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摘要
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心脑血管疾病的重要病理生理基础,给人类带来了沉重的疾病和经济负担。氧化应激在AS的启动和发生发展过程中发挥重要的作用,抗氧化剂的早期干预对于AS的防治可能具有积极的意义。原花青素是植物体内天然的抗氧化物质,具有抗氧化、抗炎、抗突变、抗肿瘤、调节血脂等多种生物学活性。研究证实其抗氧化的效果要远远优于维生素C、维生素E和p-胡萝卜素等传统抗氧化剂。荔枝壳原花青素(Procyanidins extracted from the litchi pericarp, LPPC)是华中农业大学食品科技学院天然作物实验室率先从荔枝果壳中提取出的一种以A型为主的原花青素。LPPC来源天然丰富,变废为宝,体外研究证实其具有良好的抗氧化清除自由基的能力,然而有关其抗AS的功效研究尚是空白。为了探讨LPPC对AS的改善作用及其相关机制,本研究采用高脂饮食(high fat diet,HFD)饲养载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout, ApoE KO)小鼠24周建立AS模型,观察LPPC对AS的改善效果；并从脂代谢调节、氧化抗氧化系统、以及一氧化氮系统的改变等方面探讨LPPC防治AS的可能机制。第一部分LPPC对动脉粥样硬化的保护作用目的：探讨LPPC对ApoE KO小鼠动脉粥样硬化病变程度的影响。方法：50只ApoE KO小鼠(6周龄,雄性,体重18-22 g)随机分为2组,即为ApoE KO组及LPPC干预组(ApoE KO+LPPC)。对照组为25只相同遗传背景下野生型C57BL/6小鼠。ApoE KO小鼠给予HFD(脂肪21%,蛋白质20%,胆固醇0.15%)喂养,对照组小鼠给予普通饲料喂养。LPPC组每日给予新鲜配制的LPPC溶液(100mg/kg/d)灌胃干预。实验共进行24周,期间每周记录体重及进食量。实验结束时每组随机取12只小鼠灌注后取血管标本,分别用于主动脉血管整体油红O染色、主动脉弓横截面冰冻切片油红O染色以及免疫组化检测,观察主动脉血管内粥样斑块的形成情况及巨噬细胞和平滑肌细胞的表达情况。结果：(1)血管整体油红O染色结果显示对照组WT小鼠血管内壁无红色染色斑块,ApoE KO小鼠血管内壁可见大面积连续红色粥样病变斑块,提示经过24周HFD干预ApoE KO小鼠成功建立了AS模型。LPPC干预组小鼠血管内壁同样可见粥样硬化病变斑块,但斑块呈现不连续散在分布,与模型组小鼠相比,斑块面积明显减少。采用ImagePro软件对粥样斑块部位进行测量分析,以红色斑块占动脉整体面积的百分比来代表AS的病变程度,结果提示LPPC干预后小鼠血管内壁粥样硬化斑块面积明显减少,差异具有统计学意义(ApoE KO:56.9%±8.1%, ApoE KO+LPPC:32.6%±9.2%,P<0.01)。(2)血管横截面冰冻切片油红O染色以及石蜡切片HE染色的结果提示LPPC能够显著减少ApoE KO小鼠横截面粥样硬化斑块的面积,有效改善血管内壁粥样斑块的聚集。(3)免疫组化的结果显示ApoE KO小鼠主动脉内膜和中膜下有大量的巨噬细胞聚集,LPPC干预后巨噬细胞阳性率明显减少。LPPC未能显著改变平滑肌细胞的表达情况。结论：LPPC能够有效减少动脉粥样硬化斑块的形成,改善AS病变斑块中巨噬细胞的聚集,显示出良好的抗AS发生发展的作用。第二部分LPPC改善动脉粥样硬化的相关机制研究第一节LPPC通过调节脂质代谢紊乱发挥抗动脉粥样硬化的作用目的：探讨LPPC对ApoE KO小鼠体内脂质代谢紊乱的调节作用。方法：各组小鼠行眼眶静脉丛取血后分离血浆用于血脂水平的检测；采用Folch法(即三氯甲烷／甲醇液相分离法)测定肝脏组织中总胆固醇(total cholesterol, TC)及甘油三酯(triglyceride, TG)的含量；实时定量PCR检测各组小鼠肝脏内脂代谢关键基因的表达。结果：(1)与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆TC和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)的水平显著升高(P<0.01),表现为明显的高胆固醇血症,LPPC干预后血浆TC和LDL-C的水平显著下降(P<0.01)。与对照组相比,ApoEKO小鼠血浆TG的含量略微上升(差异无统计学意义),LPPC干预后ApoE KO小鼠血浆TG的水平显著下降(P<0.05)。与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆中HDL-C的水平显著下降(P<0.05),然而LPPC未能显著升高血浆中HDL-C的水平。(2)与对照组相比,ApoE KO小鼠肝脏中TC的含量显著上升(P<0.05),TG的含量略微上升(差异无统计学意义),LPPC显著降低ApoE KO小鼠肝脏中TC和TG的含量(P<0.05)。(3)通过对肝脏脂代谢相关关键基因的检测发现,LPPC明显增加ApoE KO小鼠肝脏内PPARa mRNA的表达水平(P<0.05),增强肝脏内脂肪酸氧化的能力；LPPC显著降低ApoE KO小鼠肝脏中HMG-CoA还原酶mRNA的表达水平(P<0.05),减少肝脏内TC的合成；LPPC显著增加ApoE KO小鼠肝脏中ABCA1(P<0.01)及LXRα(P<0.05) mRNA的表达,增加胆固醇外流；此外,LPPC还能够显著增加脂代谢关键核因子FXR和SHP mRNA的表达。结论：LPPC干预显著降低ApoE KO小鼠血浆TC、TG及LDL-C的水平,降低肝脏TC及TG的含量,有效调控脂代谢相关关键基因的表达,表现出良好的改善脂质代谢的功能。调节脂代谢紊乱可能是LPPC发挥抗AS作用的机制之一。第二节LPPC通过调节一氧化氮系统平衡发挥抗动脉粥样硬化的作用目的：探讨LPPC对ApoE KO小鼠一氧化氮(nitric oxide, NO)系统的调节作用。方法：进行血浆NO水平、内皮素(endothelin-1, ET-1)水平以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)活性的检测;进行主动脉弓横截面石蜡切片iNOS和内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS, eNOS)的免疫组化检测；进行主动脉血管组织iNOS和eNOS的实时定量PCR检测和western blot检测；使用ELISA的方法进行血浆血管细胞粘附因子(vascular cell adhesion molecules-1, VCAM)水平的检测。结果：(1)与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆NO的含量显著增加,LPPC能够显著减少ApoE KO小鼠血浆NO的含量(P<0.01)。与此相反的是ApoE KO小鼠血浆ET-1的水平显著下降(P<0.05),LPPC能够逆转这种下降,明显升高血浆ET-1的水平。(2)免疫组化结果显示ApoE KO小鼠主动脉内膜和中膜下均有大量的iNOS蛋白表达,而LPPC组小鼠主动脉仅可见少量iNOS蛋白表达,说明LPPC能够有效减少主动脉中iNOS的表达。PCR的结果显示,ApoE KO小鼠主动脉组织iNOS mRNA的表达与对照组相比显著增加(P<0.01),LPPC能够显著降低主动脉组织中iNOS mRNA的表达水平(P<0.05)。western blot的结果,ApoE KO小鼠主动脉组织中iNOS蛋白的表达水平与对照组相比显著增加(P<0.05),LPPC能够显著降低主动脉组织中iNOS蛋白的表达水平(P<0.05)。与此一致的是ApoE KO小鼠血浆iNOS的活性与对照组相比显著增加(P<0.01), LPPC能够显著降低血浆iNOS的活性(P<0.05)。(3)与iNOS的表达相反,免疫组化结果显示ApoE KO小鼠主动脉内膜仅有少量的eNOS蛋白表达,LPPC显著增加eNOS蛋白的表达。PCR和western blot的结果也显示ApoE KO小鼠主动脉组织eNOS mRNA和蛋白的表达与对照组相比显著减少,LPPC显著增加主动脉组织eNOS mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。(4)与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆VCAM的水平明显增加(P<0.01),LPPC显著降低血浆VCAM的水平(P<0.01)。结论：ApoE KO小鼠血浆NO含量的大幅度增加可能是由iNOS的异常高表达所导致的,LPPC能够有效改善iNOS异常表达引起的NO大量释放。这种调节NO系统平衡的作用可能是LPPC发挥抗AS作用的机制之一。第三节LPPC通过调节氧化抗氧化系统平衡发挥抗动脉粥样硬化的作用目的：探讨LPPC对ApoE KO小鼠体内氧化抗氧化系统的调节作用。方法：按照试剂盒说明书进行血浆氧化抗氧化系统相关重要指标的检测,如抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione, GSH)的水平,抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的活性,脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的水平等。实时定量PCR检测各组小鼠主动脉组织中NADPH酶亚基(p22phox、p47phox、P67phox、NOX-1、NOX-2/gp91phox和NOX-4)mRNA的表达水平。结果：(1)与ApoE KO组相比,LPPC能够显著增加ApoE KO小鼠血浆GSH的含量(P<0.01)。(2)与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆MDA的含量显著增加(P<0.01), LPPC干预后血浆MDA的含量显著减少(P<0.05)。(3)与对照组相比,ApoEKO小鼠血浆SOD的活性显著降低(P<0.05),LPPC干预未能显著增加血浆SOD的活性。与对照组相比,ApoE KO小鼠血浆GPx的活性显著降低(P<0.05),LPPC干预后血浆GPx活性略有上升,但差异无统计学意义。与ApoE KO组相比,LPPC能够显著增加血浆CAT的活性(P<0.05),并且能够显著升高CAT/SOD的比值(P<0.01)。(4)通过对主动脉组织NADPH酶亚基mRNA表达水平的检测发现,与对照组相比,ApoE KO小鼠主动脉组织p22 phox、p47phox、p67phox、NOX-2/gp91phox和NOX-4等亚基m RNA的表达水平显著增加(P<0.05),LPPC能够显著减少主动脉组织中p47phox、p67phox、NOX-2/gp91phox和NOX-4iNOS mRNA的表达水平(P<0.05)。结论：LPPC能够显著提高ApoE KO小鼠体内抗氧化的能力,且能够通过降低NADPH酶的活性抑制主动脉血管组织ROS的产生,这种抑制ROS产生及提高机体抗氧化能力的作用可能是LPPC发挥抗AS作用的机制之一。
