应用CRISPR-Cas13a和手机显微镜进行新型冠状病毒的无扩增检测

来源：中华实验和临床病毒学杂志, 2022, 36(03).

虽然目前诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的金标准, 即实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于人群筛查并且检测限可低至1拷贝/μl, 但最新的病毒动力学模型表明, 相较于灵敏度而言, 高频率检测和快速诊断才是减少病毒传播的关键。因此, 研究人员正努力探索基于CRISPR-Cas技术的病毒RNA检测新策略。其中, Cas13a蛋白可与CRISPR RNA(crRNA)形成复合物并在crRNA的引导下靶向结合目的RNA序列, 激活核酸酶活性, 非特异地切割附近的任意单链RNA。利用这一特性, 将带有荧光淬灭基团的RNA探针加入体系, 可检测靶RNA序列。在此原理上, 本研究开发了一种突破性方法, 无需前期预扩增即可直接从鼻拭子RNA中检测SARS-CoV-2。通过设计针对病毒N基因和E基因的不同区域的多个crRNA, 等浓度组合加入反应体系, 使单次反应可以激活更多的Cas13a蛋白, 检测灵敏度提高的同时也减少了基因突变导致检测脱靶的可能性, 整个检测过程均在样品中直接进行, 无需额外操作。此外, 该新型检测平台还可以将反应速率和产生的荧光信号转化为病毒载量, 样本定性的同时进行RNA定量。为了提高检测的简单性和便携性, 本研究还设计了一个小型设备包括低成本的激光照明和光收集元件, 可以通过手机摄像头读取CRISPR-Cas13a检测产生的荧光信号, 灵敏度达到100拷贝/μl的同时能够在5 min内准确诊断出一组从新型冠状病毒肺炎患者样本中预提取的RNA。本研究开发的方法有可能为现场SARS-CoV-2筛查提供一种快速、准确、便携和低成本的选择。