肠出血性大肠杆菌转移紧密黏附素受体的表达及其活性鉴定

作者：肖乐; 王琴; 蔡昆; 屠伟; 侯晓军; 李涛; 王慧

来源：现代生物医学进展, 2010, 10(09): 1646-1649.

DOI：10.13241/j.cnki.pmb.2010.09.002

• 肠出血性大肠杆菌
• Tir
• 表达
• 活性鉴定

目的:在原核表达基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转移紧密黏附素受体(Translocated Intim in Receptor,Tir)蛋白的高效表达,并对其活性进行初步鉴定。方法:采用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中调取tir基因,插入pEASY-T1克隆载体。克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶双酶切pEASY-T1-tir质粒获得tir基因,连接同样经过双酶切的pET-22b(+)。表达质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测相对分子质量,Western blotting验证抗原活性。荧光显微镜观察蛋白是否具有嵌入细胞膜的活性。结果:PCR扩增得到1686bp的目的片段。构建的原核表达质粒pET-22b(+)-tir经酶切鉴定及测序与预期序列一致。目的蛋白以裂解上清形式表达,表达量约3mg/ml。经镍柱纯化后纯度达90%以上。重组表达的Tir具有嵌入细胞膜的生物学功能。结论:成功表达了具有生物活性的重组Tir蛋白,为Tir的功能研究奠定基础。

• 单位
  病原微生物生物安全国家重点实验室; 军事医学科学院