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摘要
目的探讨脓毒症小鼠中性粒细胞对T淋巴细胞(T细胞)功能的影响以及CD80/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)途径在其中发挥的作用。方法①体内实验:将6～8周龄雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组, n=20)、Sham+CTLA-4抗体处理组(Sham+aCTLA-4组, n=20)、盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型组(CLP组, n=30)和CLP+CTLA-4抗体处理组(CLP+aCTLA-4组, n=30)。采用CLP制备小鼠脓毒症模型;Sham组不对盲肠进行结扎和穿孔, 余操作同CLP组;CTLA-4抗体处理组分别于术后6 h、24 h腹腔注射CTLA-4抗体50 μg。术后48 h, Sham组、Sham+aCTLA-4组随机取6只小鼠, CLP组和CLP+aCTLA-4组随机取14只小鼠检测脾脏T细胞活化指标CD69的表达;并取脾脏、骨髓和外周血, 应用流式细胞仪检测中性粒细胞表面CD80的表达;采用免疫荧光法和流式细胞仪检测脾脏T细胞表面CTLA-4的表达。各组其余小鼠用于观察术后96 h生存情况。②体外实验1:提取健康小鼠骨髓中性粒细胞, 分别用LPS(1 mg/L)刺激4、8、12 h, 每个时间点设置加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)的对照组, 检测各时间点CD80的表达。③体外实验2:提取健康小鼠脾脏T细胞, 分为PBS对照组、LPS组(LPS终浓度1 mg/L)、中性粒细胞组和中性粒细胞+LPS组, 后两组建立中性粒细胞与T细胞共培养模型后再给予相应处理, 检测T细胞表面CTLA-4的表达;以上述4组为对照, 再分别设置CTLA-4抗体处理组(CTLA-4抗体终浓度50 mg/L), 48 h后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中白细胞介素-2(IL-2)水平。结果①体内实验结果:与Sham组比较, CLP组脾脏、骨髓、外周血中性粒细胞表面CD80表达均上调, T细胞表面CTLA-4表达明显增加〔(9.98±0.84)%比(3.48±0.64)%, P<0.05〕, 说明脓毒症时中性粒细胞可能通过CD80/CTLA-4途径影响T细胞功能。与CLP组比较, CTLA-4抗体可明显提高CLP小鼠96 h累积生存率(56.25%比18.75%, P<0.05), 增加T细胞表面CD69的表达, 说明CTLA-4抗体可能会促进脓毒症时T细胞活化, 并提高生存率。②体外实验结果:随LPS刺激时间延长, 中性粒细胞表面CD80表达较PBS对照组明显增加, 并呈一定时间依赖性〔4 h:(6.35±0.40)%比(3.41±0.40)%, 8 h:(8.57±0.64)%比(3.09±0.27)%, 12 h:(19.83±1.06)%比(5.16±0.36)%, 均P<0.05〕。与PBS对照组比较, 单纯LPS刺激对CD4+/CD8+ T细胞表面CTLA-4的表达没有明显影响, 而与中性粒细胞共培养后CTLA-4的表达明显增加〔CD4+:(4.92±0.30)%比(3.33±0.25)%, CD8+:(4.26±0.21)%比(2.53±0.66)%, 均P<0.05〕, 与LPS刺激的中性粒细胞共培养后CTLA-4表达的增加趋势则更加明显〔CD4+:(6.34±0.50)%比(3.33±0.25)%, CD8+:(6.21±0.41)%比(2.53±0.66)%, 均P<0.05〕。在PBS对照组和LPS组中, CTLA-4抗体对T细胞分泌IL-2无明显影响。与PBS对照组比较, 与中性粒细胞共培养能抑制T细胞分泌IL-2(ng/L:1 938.00±68.45比2 547.00±218.00, P<0.05), 与LPS刺激后中性粒细胞共培养则抑制作用更明显(ng/L:1 073.00±34.39比2 547.00±218.00, P<0.05);而CTLA-4抗体的加入可部分恢复IL-2的分泌。说明中性粒细胞在促进T细胞表面CTLA-4表达后, 可能通过减少IL-2生成来介导T细胞功能抑制。结论脓毒症时中性粒细胞可介导T细胞功能障碍, 而CD80/CTLA-4途径在其中发挥了重要作用。拮抗CTLA-4后, 脓毒症小鼠生存率和T细胞功能明显改善, 这可能会成为脓毒症免疫治疗的新方法。
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