突变APP荧光融合基因的构建和表达

作者：李晓晴; 薛峥; 张苏明

来源：华中科技大学学报(医学版), 2007, (06): 795-797+856.

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2007.06.025

• 阿尔茨海默病
• 淀粉样蛋白前体
• Flemish突变
• 基因融合

目的探讨阿尔茨海默病(Alzheimer disease)的发病机制,研究淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)酶解过程,构建含有APP Flemish突变的荧光真核表达系统。方法通过聚合酶链式反应(PCR)得到含有Flem-ish突变的APP最后300 bp片段(C99)、黄色荧光蛋白碱基序列(yellow fluorescence protein,YFP),利用基因工程技术将YFP、C99片段克隆至载体质粒pcDNA3.0中,通过酶切,测序鉴定最终得到重组质粒pcDNA3.0-YFP-C99,将其转染至人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中,利用激光共聚焦显微镜观察融合基因表达和Aβ的生成,MTT检测转染细胞活性。结果①基因序列分析证明重组质粒构建成功;②激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光分布于转染细胞内,表明融合基因能够准确表达荧光;③MTT检测显示Aβ生成后细胞活性下降,差异有极显著性意义(P<0.01);④激光共聚焦显微镜下观察YFP-C99能够生成Aβ,转染细胞内有荧光颗粒聚集沉积,形态异常。结论荧光标记APP Flemish突变重组质粒构建成功,为进一步在体研究APP的有序裂解特别是γ裂解活动奠定了基础。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属同济医院; 神经内科