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摘要
目的 CRISPR介导的基因编辑对基因治疗带来了巨大的前景,目前已有多项基于CRISPR的研究用于阿尔茨海默症的治疗。然而目前将CRISPR递送到相应的细胞甚至体内应用依然缺乏安全有效的手段,在细胞层面目前主要依赖于电转手段将CRISPR系统运送到细胞中,操作上比较复杂。而基于慢病毒和AAV的CRISPR递送体系不仅会造成免疫原性,而且往往容易整合到基因组中长期表达,引发不良后果。本研究拟基于外泌体的递送策略改善该问题。方法本论文采用构建工程化的外泌体平台,采用基于com和配体结合蛋白Com的富集系统,可以高效富集CRISPR系统并降低其脱靶效应和免疫原性。结果构建了多种RNP验证其效果,在细胞水平发现其富集RNP(spCas9,saCas9以及ABE系统)效率可以达到10倍以上,同时其脱靶效率显著降低。该系统不仅可以单独包装,也可以将多个RNP进行共包装,而且发现共包装外泌体系统优于单独的外泌体相加。同时也在体内水平验证了该系统的基因编辑效率,在del52hDMD/mdx小鼠模型中,注射包装了DMD exon 53 RNP的外泌体,通过confocal也观察到了肌肉dystrophin蛋白的表达。结论提供了一种免疫原性低于病毒系统的广泛性的RNP递送系统,且其效率显著高于同类型的外泌体系统。基于外泌体独特的免疫原性和归巢特性,以及穿过血脑屏障等特点,该系统对于神经性疾病的治疗中具有潜在的意义。
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