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摘要
目的设计基于纳米荧光素酶(Nluc)的新型荧光报告系统, 构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN, 分析该噬菌体检测结核分枝杆菌耐药性的能力。方法构建PfurAma启动子控制表达的Nluc荧光报告系统, 将其整合至耻垢分枝杆菌基因组中, 测试其在分枝杆菌的荧光报告能力;随后将PfurAma-nluc报告系统整合到TM4分枝杆菌噬菌体基因组中, 构建新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN;通过调整药物预处理时间、感染时间等条件, 建立ΦFN检测分枝杆菌耐药性的快速检测流程, 在96孔板中检测52株已知耐药性的结核分枝杆菌临床分离株对3种一线抗结核药物耐药的耐药性。结果整合型表达荧光报告系统PfurAma-nluc的耻垢分枝杆菌可报告下限达到100菌落形成单位(colony-forming unit, CFU), 低于已报道的Pleft启动子表达nluc系统。新型分枝杆菌荧光报告噬菌体ΦFN可通过孔板读值法在24 h内检测到分枝杆菌的存在, 检测下限达到100 CFU。药物与待测菌预培养48 h后再加入噬菌体孵育24 h, 敏感菌在105 CFU以下均无法检测到荧光信号, 可有效区分敏感株并进行耐药性的快速检测。以罗氏药敏实验作为金标准, 使用ΦFN检测52株结核分枝杆菌临床菌株对利福平、异烟肼和链霉素的耐药性, 检测准确性分别是51/52、48/52、49/52。结论利用新型重组荧光报告噬菌体检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素的耐药性具有极高的准确性, 报告时间仅需3 d, 有望成为一种快速简便的结核分枝杆菌耐药性检测新方法。
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