SIRT7基因乙酰化活性缺失突变真核表达载体的构建

作者：李小娜; 梁慧敏; 王天晓; 韩飞; 刘文斌; 郑立娟; 董严; 刘晋祎; 时小燕

来源：河南大学学报(医学版), 2015, 34(02): 87-90.

DOI：10.15991/j.cnki.41-1361/r.2015.02.003

• SIRT7
• Two-step PCR
• 定点突变
• 真核表达载体

目的构建SIRT7基因乙酰化活性缺失的定点突变真核表达载体。方法用RT-PCR法从293T细胞中扩增SIRT7基因,并克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(-)A上。采用Two-step PCR定点突变技术,构建SIRT7基因的H187Y突变质粒,经测序确证定点突变成功,再将SIRT7及突变载体转染293T细胞,Western blot检测融合蛋白表达。结果克隆出SIRT7基因,构建了真核载体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7,经Two-step PCR获得突变体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y。DNA测序结果表明,编码187位氨基酸的560562位碱基由CAC突变为TAC,其他碱基均无突变。SIRT7和H187Y突变载体转染293T细胞后,可检测出myc-SIRT7融合蛋白表达。结论成功构建了SIRT7以及H187Y突变的真核表达载体。

• 单位
  河南大学; 第三军医大学; 河南大学淮河医院; 甘肃省人民医院