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摘要
目的获得来源于嗜热脂肪芽胞杆菌色氨酰-tRNA合成酶(BsTrpRS)与创新霉素复合物的晶体结构,为创新霉素的理性设计提供结构基础。方法利用大肠杆菌表达系统异源表达获得BsTrpRS可溶性表达,采用亲和层析色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱纯化目的蛋白,以期获得纯度在90%以上的BsTrpRS,通过等温滴定量热法检测BsTrpRS与创新霉素的亲和力。选用悬滴-水蒸汽扩散法筛选蛋白质结晶条件,通过优化结晶条件获得高质量晶体,利用上海光源蛋白质晶体学光束线站收集X-ray衍射数据。结果运用分子生物学方法成功构建含bstrprs基因的重组质粒,转化BL21(DE3)得到重组表达菌株。运用亲和层析、离子交换色谱和分子排阻色谱等蛋白纯化技术,获得高纯度BsTrpRS蛋白。利用ITC技术确证创新霉素与BsTrpRS之间亲和力为3.2μmol/L。通过晶体筛选优化,最佳结晶条件为1.8 mol/L K2HPO4,pH 7.6,37℃,0.75%(v/v)1,3-丙二醇,最终获得X-ray衍射分辨率为2.06?的BsTrpRS/创新霉素二元复合物晶体,其晶胞参数为a=91.675?,b=91.675?,c=152.37?,α=90.000°,β=90.000°,γ=120.000°,晶体的马修斯系数为2.48?3/Da,最小非对称单位内含有2个蛋白分子,溶剂百分比为50.46%。结论创新霉素与BsTrpRS复合物晶体结构的获得,有望对创新霉素小分子结构优化及设计提供指导方向及重要依据。
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