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摘要
猪急性腹泻综合症冠状病毒(SADS-CoV)是一种新发现的肠道冠状病毒，引起仔猪严重的临床腹泻和肠道病理损害。为探究甘草提取物的主要成分甘草酸(GLY)抑制SADS-CoV复制的机制，本研究利用不同浓度的GLY对非洲绿猴肾细胞(Vero E6)和猪回肠上皮细胞(IPI-2I)预处理2 h并感染不同浓度的SADS-CoV后，分别经western blot和TCID50检测，结果显示N蛋白的表达量显著减少且病毒滴度下降，表明GLY在体外能够抑制SADS-CoV的感染。利用不同浓度GLY对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后，感染灭活的SADS-CoV,western blot结果显示在GLY浓度为0.8 mmol/L时，N蛋白表达量显著减少，表明GLY能够抑制该病毒的侵入。选取0.4 mmol/L GLY处理细胞，再感染SADS-CoV后2 h、6 h、12 h收取细胞样品经western blot检测，结果显示各时间点N蛋白表达量均显著减少，表明GLY对该病毒的复制抑制效果显著。GLY是高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的竞争性抑制剂，而HMGB1的受体主要有TLR4和RAGE，因此构建了HMGB1关键性位点(C45S、C106S、C45/106S)突变的质粒和RAGE受体的siRNA，分别转染Vero E6细胞并感染SADS-CoV，收获上清液和细胞样品，利用western blot和TCID50检测。结果显示，N蛋白表达量显著减少且病毒滴度下降，表明GLY在SADS-CoV感染时通过影响HMGB1与TLR4和RAGE的结合而发挥功能。为了进一步探究GLY发挥作用的信号通路，分别将SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I细胞，收获细胞样品，利用western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的变化，结果显示p-p38、p-JNK、p-ERK表达量在感染早期和晚期上调，表明SADS-CoV感染激活了MAPK通路。利用不同浓度的GLY和TLR4抑制剂TAK对Vero E6和IPI-2I细胞预处理2 h后感染SADS-CoV，收获蛋白样品，western blot结果显示p-JNK和N蛋白表达量显著减少，其他蛋白无明显变化，表明GLY和TAK调控JNK的磷酸化，而不能调控p38和ERK的磷酸化。利用HMGB1中和抗体预处理Vero E6细胞、将HMGB1的siRNA以及构建的HMGB1关键位点突变的真核表达质粒分别转染Vero E6细胞后感染SADS-CoV，收获上述细胞样品，western blot结果显示p-JNK的表达量均减少，表明HMGB1影响了JNK的磷酸化；利用不同浓度的JNK抑制剂SP600125对Vero E6和IPI-2I预处理2 h，再感染SADS-CoV，利用western blot、TCID50和IFA检测，结果显示N蛋白表达量及病毒滴度均下降且病毒复制减少，表明SP600125抑制了病毒的复制。综上所述，本研究首次证实GLY主要通过HMGB1/TLR4/JNK信号通路抑制SADS-CoV的体外复制，该通路的发现为研究抗SADS-CoV的新型药物提供了数据支持。
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单位兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
