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摘要
目的:基于NF-κB信号通路探讨独活寄生汤抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制。方法:取4周龄SPF级SD大鼠双侧膝关节软骨,分离软骨细胞进行体外培养。取培养的第2代软骨细胞,随机分为5组。空白组中加入含10%FBS的DMEM培养基,模型组加入含10 ng·mL-1脂多糖的10%FBS DMEM培养基,独活寄生汤低、中、高浓度组加入含脂多糖(10 ng·mL-1)和独活寄生汤(浓度分别为100μg·mL-1、200μg·mL-1、300μg·mL-1)的10%FBS DMEM培养基。干预8 h后,采用ELISA法测定各组细胞培养液上清液中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9含量,确定独活寄生汤最佳干预浓度。随后取培养的第2代软骨细胞,随机分为4组。空白组不进行干预,模型组加入10 ng·mL-1脂多糖,独活寄生汤组加入10 ng·mL-1脂多糖和最佳浓度的独活寄生汤,抑制剂组加入10 ng·mL-1脂多糖和10μmol吡咯烷二硫代甲酸铵盐。干预8 h后,采用荧光定量PCR法检测软骨细胞中NF-κB基因含量、用免疫荧光检测法观察软骨细胞中NF-κB蛋白核转位情况。结果:①独活寄生汤最佳干预浓度测定结果。空白组、模型组、独活寄生汤低浓度组、独活寄生汤中浓度组、独活寄生汤高浓度组的MMP-9含量比较,差异有统计学意义[(0.125±0.012)ng·mL-1,(0.154±0.008)ng·mL-1,(0.148±0.012)ng·mL-1,(0.148±0.010)ng·mL-1,(0.134±0.002)ng·mL-1,χ2=10.034,P=0.040]。模型组的MMP-9含量高于空白组和独活寄生汤高浓度组(P=0.002,P=0.006);空白组与独活寄生汤高浓度组比较,差异无统计学意义(P=0.573);独活寄生汤低、中浓度组MMP-9含量与模型组比较,差异均无统计学意义(P=0.483,P=0.356)。上述测定结果显示独活寄生汤最佳干预浓度为300μg·mL-1。②软骨细胞中NF-κB基因含量。空白组、模型组、独活寄生汤组、抑制剂组的NF-κB基因含量比较,差异有统计学意义[1.013±0.015,1.848±0.216,1.454±0.250,1.289±0.332,F=8.859,P=0.002]。模型组的NF-κB基因含量高于空白组、独活寄生汤组和抑制剂组(P=0.000,P=0.035,P=0.006);独活寄生汤组的NF-κB基因含量高于空白组(P=0.021);独活寄生汤组的NF-κB基因含量与抑制剂组比较,差异无统计学意义(P=0.341)。③软骨细胞中NF-κB蛋白核转位情况。各组软骨细胞核均呈蓝色;软骨细胞NF-κB蛋白染色明显,呈绿色;模型组NF-κB蛋白核转位最为明显,空白组、抑制剂组NF-κB蛋白核转位相对较少,独活寄生汤组NF-κB蛋白核转位情况介于空白组与模型组之间。结论:独活寄生汤可通过抑制NF-κB蛋白核转位,减轻脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应,从而延缓软骨退变。
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