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摘要
目的阿尔茨海默病(AD)脑内的主要病理特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)在胞外沉积形成的神经炎性斑及过磷酸化的tau蛋白在胞内异常聚集形成的神经原纤维缠结。病理性tau蛋白与神经损害、病情严重程度密切相关,因此脑内病理性tau蛋白的清除是AD防治的重要途径。研究发现tau蛋白可从脑内流向外周血液,但其流入外周血后如何被清除尚不清除。本研究旨在探讨脑内tau蛋白的生理性外周清除机制,以及生理性外周清除机制在清除脑内病理性tau蛋白中的作用;并进一步探讨增强tau蛋白的外周清除能力对脑内病理性tau蛋白清除的影响。方法 (1)首先向野生型(WT)小鼠的小脑延髓池或尾静脉注射放射性同位素131I标记的重组人tau蛋白(131I-tau),在注射后的15,30 min,1,4和8 h分别检测小鼠脑组织及外周各组织脏器的131I放射性,计算tau蛋白在脑内及外周血的清除半衰期。然后纳入20例因患有房室折返性心动过速而接受射频导管消融术的患者,同时从股动脉和下腔静脉(肝静脉开口近端)采集血液,ELISA方法检测血浆总tau(t-tau)浓度。(2)首先在两只年龄和性别匹配的WT小鼠间建立WT-WT并联共生模型,向其中一只并联小鼠的小脑延髓池注射131I-tau,在注射后15 min,1和4 h分别检测注射侧并联小鼠和未并联的单只WT小鼠脑组织和外周脏器的131I放射性。然后建立携带P301L突变的人tau转基因小鼠(p R5小鼠)和性别匹配的同窝WT小鼠的长期并联共生模型,并联3个月后,利用免疫组化染色、免疫印迹及ELISA方法检测并联组p R5小鼠和对照组p R5小鼠脑内病理性tau蛋白的水平,计算外周系统对清除脑内病理性tau蛋白的贡献。然后通过ELISA、免疫荧光双染、免疫印迹和电生理膜片钳技术等方法,观察并联共生对脑内病理性tau介导的神经炎症、神经变性及突触可塑性的影响。(3)首先纳入23例因患有慢性肾病(CKD)而首次接受腹膜透析的患者,采集透析前及透析4 h后的静脉血,ELISA方法检测透析前后血浆病理性tau蛋白(p T181-Tau)的水平。其次给p R5小鼠进行腹膜透析2 h,利用微透析方法收集腹膜透析前及透析后第1,2,3,4,5,6,7和8 h的微透析液样本及同时间点的尾静脉血,ELISA方法检测血液和微透析液中病理性tau蛋白的水平。结果 (1)脑内tau蛋白的生理性外周清除机制:(1)脑脊液tau蛋白的清除速率:WT小鼠经小脑延髓池注射131I-tau后,脑组织的131I放射性在1 h内迅速下降,其代谢半衰期约为3 h,提示注射的tau蛋白被清除。在注射后的15 min,血液内已可检测到较强的131I放射性,提示脑内tau蛋白可迅速转移至外周循环。(2) tau蛋白的外周途径清除:WT小鼠经尾静脉注射131I-tau后,血液的131I放射性随时间延长而降低,其代谢半衰期为3.4 h。提示外周系统具有清除tau蛋白的功能。(3) tau蛋白外周清除的组织定位:131I-tau经小脑延髓池或尾静脉注射后,在外周系统,血液和肾脏的131I放射性最高,其次是肝脏,且血液及肾脏的131I放射性随时间延长而减弱,提示血液、肾脏和肝脏是tau蛋白外周清除的主要部位。(4)人体tau蛋白的外周清除能力:人体动脉血tau蛋白水平显著高于下腔静脉血,说明动脉血内tau蛋白经过体循环后,被所流经的外周脏器和组织清除,提示生理条件下,人体外周系统具有清除tau蛋白的功能。(2)生理性tau蛋白外周清除在清除脑内病理性tau蛋白中的作用:(1)并联共生模型增加脑内tau蛋白的清除速度:WT小鼠小脑延髓池注射131I-tau后,与未并联的WT小鼠相比,并联组注射侧小鼠脑组织131I放射性的下降速率更快,提示增加一套外周系统,可加速脑内tau蛋白的清除。(2)并联共生对脑内病理性tau蛋白的清除作用:并联组p R5小鼠脑内皮质、海马和杏仁核区域的病理性tau蛋白均较对照组p R5小鼠降低;且tau蛋白的Ser404,Thr231,Ser199和Thr181几个位点的磷酸化水平均显著降低;ELISA结果显示,并联p R5小鼠脑组织TBS提取物中(TBS可溶)和SDS提取物中(TBS不可溶)的tau蛋白Thr231和Thr181位点的磷酸化水平均较对照组降低。根据ELISA检测的Thr231结果,我们推算出脑内约19%的病理性tau蛋白通过外周途径清除。(3)并联共生对脑内tau蛋白相关病理的影响:并联共生可降低p R5小鼠脑内的促炎因子TNF-α和IFN-γ水平,提示并联共生可减轻p R5小鼠脑内的炎症反应。与对照组p R5相比,并联p R5小鼠脑内Map-2阳性染色面积增加,胱天蛋白酶3染色面积减少,提示并联共生减轻p R5小鼠脑内神经轴突结构的破坏,减少神经元凋亡;突触后膜结构蛋白PSD-95和PSD-93,囊泡相关蛋白synaptophysin,SNAP-25和VAMP-1,在并联p R5组较p R5对照组增多,提示并联共生减轻p R5小鼠脑内突触结构及功能的破坏。以上结果提示并联共生可改善脑内神经变性。但是对照组p R5小鼠和并联组p R5小鼠海马区的LTP并无显著差异。(3)增强tau蛋白外周清除降低脑内病理性tau蛋白水平:(1)腹膜透析对血液tau蛋白的清除作用:CKD患者腹膜透析后血液p T181-tau水平较透析前降低,提示腹膜透析可有效清除血液病理性tau蛋白。(2)腹膜透析促进脑内病理性tau蛋白的清除:腹膜透析开始后,p R5小鼠血浆t-tau水平显著降低,提示腹膜透析可有效清除血液内tau蛋白。ISF中t-tau与p-tau水平在腹膜透析后亦明显下降,其变化趋势与血浆tau基本一致,提示腹膜透析可以通过降低血液中的tau蛋白水平,进一步降低脑内病理性tau蛋白。结论本研究首次证明机体存在tau蛋白的生理性外周清除机制,即生理条件下,tau蛋白可从脑内转移至外周系统,并被外周系统清除;并联共生研究表明脑内约19%的病理性tau蛋白经外周清除机制代谢,提示生理性外周清除在脑内病理性tau蛋白的清除中发挥重要作用;增强tau蛋白外周清除可促进脑内病理性tau蛋白的清除,是AD及其他tau蛋白病的潜在防治途径。本研究揭示了外周系统对脑内病理性tau蛋白的生理性清除功能,并为通过增强tau的外周清除能力治疗AD及其他tau蛋白病提供了概念验证性证据,同时为通过系统途径理解其他神经退行性疾病的发病机制及寻找治疗策略提供了借鉴。
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单位神经内科
