当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆与表达分析

作者：张培; 侯云龙; 苏敏; 孙利; 徐登封; 宋涛; 周璐恒; 赵韶华^*

来源：中国野生植物资源, 2021, 40(01): 20-28.

• 当归
• COMT
• 荧光定量PCR
• 原核表达
• 最佳表达条件

目的:为了研究当归阿魏酸生物合成途径的功能基因,从当归中克隆了一条当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(AsCOMT),进行生物信息学分析、基因表达模式分析及原核表达。方法:首先依据当归COMT基因的序列(GenBank注册号KP188587),利用PCR的方法克隆该基因的cDNA全长。对AsCOMT基因进行实时荧光定量PCR分析。采用无缝克隆技术构建AsCOMT基因的原核表达载体,通过热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)。进一步利用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导大肠杆菌表达重组蛋白,并筛选出最佳IPTG诱导表达条件。结果:AsCOMT基因的开放阅读框为1 098 bp,编码365个氨基酸,蛋白分子量约为40.230 kDa,等电点为5.43。AsCOMT蛋白含有1个S-腺苷-L-甲硫氨酸结合位点,属于COMT蛋白家族成员。通过实时荧光定量表达分析表明,AsCOMT基因在当归的不同组织均有表达,根中表达量最高,其次是叶片,叶柄中表达量最低。原核表达载体pGEX-4T-3-AsCOMT在E.coli BL21(DE3)中大量表达当归AsCOMT蛋白,且经SDS-PAGE分析显示其相对分子质量约为40.23 kDa,其最优表达条件为25℃、1.0 mmol/L IPTG终浓度、诱导8 h,得到的当归AsCOMT蛋白主要以可溶性形式存在。结论:本研究成功克隆了AsCOMT基因,且该基因的表达具有组织特异性。构建的AsCOMT原核表达菌株在最适IPTG诱导表达条件下能大量表达当归COMT蛋白,为研究COMT基因在当归阿魏酸生物合成途径中的功能奠定了基础。

• 单位
  石家庄以岭药业股份有限公司; 石家庄市第二医院; 承德医学院