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摘要
【目的】筛选出禽传染性支气管炎病毒（IBV）非结构蛋白4(nsp4)抗原性较好的氨基酸区域并制备多克隆抗体，为进一步研究nsp4蛋白在IBV复制过程中的功能提供物质基础，也为研发IBV新型诊断试剂盒与疫苗打下基础。【方法】对IBV Beaudette株nsp4蛋白进行原核表达，以融合蛋白nsp4作为免疫原免疫健康日本大耳白兔和健康阴性鸡，制备相应的兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体，并通过间接ELISA检测、Western blotting检测及IFA验证等对制备获得的多克隆抗体进行生物学功能研究。【结果】选取nsp4蛋白第408～514位氨基酸作为原核表达序列，成功构建了nsp4蛋白原核表达载体pCZN-1-HIS-nsp4和nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA。原核表达的融合蛋白nsp4为13.6 kD，与预期结果相符，能与IBV GX-YL5株和M41株全病毒阳性血清反应。制备的兔、鸡多克隆抗体血清效价分别为1∶128000和1∶6400，均能与融合蛋白nsp4和IBV全病毒反应，且与IBV GX-YL5株、Beaudette株和M41株感染鸡胚肾细胞（CEK）表达的nsp4蛋白反应，还能与转染状态及感染IBV Beaudette株的非洲绿猴肾细胞（Vero）表达nsp4蛋白反应。实时荧光定量PCR检测结果表明，经nsp4蛋白真核表达载体pVAX1-nsp4-HA转染后，Vero细胞的病毒载量呈逐渐上升趋势，即体外过表达nsp4蛋白能促进IBV的复制。【结论】制备获得的2种IBV nsp4多克隆抗体效价高、反应性良好、特异性强，可作为细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具，用于解析nsp4蛋白在IBV增殖过程中的作用机制，也为其他冠状病毒nsp4蛋白的研究提供参考。
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