卡介苗Hsp16.3基因突变株对小鼠巨噬细胞RAW 264.7自噬的影响

作者：杨丽; 师长宏; 赵勇; 张彩琴; 白冰

来源：科学技术与工程, 2016, 16(23): 7-34.

• 热休克蛋白16.3
• 卡介苗
• 自噬
• 同源重组

构建及鉴定卡介苗(BCG)Hsp16.3基因突变株,观察该突变株对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增Hsp16.3基因两侧分子量分别为663 bp和684 bp的两个DNA片段,并将这两个目的片段分别插入p KO载体上相应的位点。通过硫酸卡那霉素筛选,利用双酶切以及测序的方法,获得阳性重组质粒p KO-Hsp16.3。将阳性重组质粒p KO-Hsp16.3电转入BCG感受态细胞中,经过硫酸卡那霉素和蔗糖两次筛选,得到BCG Hsp16.3基因突变株。将筛选培养的BCG Hsp16.3突变株用于小鼠巨噬细胞的感染实验,并通过Western Blot和细胞免疫荧光技术对自噬相关蛋白的表达水平的变化进行观察及分析。成功获得重组质粒p KO-Hsp16.3的阳性克隆;电转化该重组质粒,并经过硫酸卡那霉素筛选和蔗糖反筛选,成功得到BCG Hsp16.3基因突变株。通过Western Blot以及免疫荧光分析发现,BCG Hsp16.3基因的突变株促进了小鼠巨噬细胞自噬的发生。

• 单位
  第四军医大学; 成都医学院