Mtb-EVs的提取及其对鼠源树突状细胞ROS和炎症因子表达的影响

作者：陈光璋; 范芳芳; 邓思茜; 夏欣怡; 卞小川; 任依涵; 韦莉^*

来源：四川大学学报（医学版）, 2023, 54(01): 122-127.

• 结核分枝杆菌
• 胞外囊泡
• 树突状细胞

目的 提取结核分枝杆菌(M. tuberculosis, Mtb)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)，检测其形态、粒径大小及分布，研究Mtb-EVs对树突状细胞(dendritic cell, DC)胞内活性氧(ROS)和细胞因子水平的影响，初步探讨其对DC的免疫调节作用。方法 超滤浓缩法分离获取Mtb-EVs,BCA法检测蛋白浓度，负染电镜检测Mtb-EVs形态，纳米颗粒跟踪分析技术检测其粒径大小分布和浓度；无菌分离获取小鼠骨髓，经重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rm IL-4)联合诱导扩增出DC，并进行形态学及免疫表型鉴定；用不同剂量Mtb-EVs作用于DC,DCFH-DA荧光探针法检测DC胞内ROS水平，ELISA法检测DC细胞IL-1β和IL-6分泌。结果 超滤浓缩法提取的Mtb-EVs为大小不等的球状囊泡结构，形态典型，直径约100 nm;NanoSight纳米颗粒追踪仪检测结果显示，粒径峰值98.5 nm，平均粒径110.2 nm，主要分布在68.4～155.7 nm之间，小于250 nm囊泡数量占总量98.39%；体外定向诱导扩增的细胞具有典型DC的形态特征，纯度可达85%以上，透射电镜可见DC表面有丰富微绒毛及放射状突起，胞浆均匀，核膜清晰；102、103、104particles/cell Mtb-EVs处理DC后，ROS水平与Mtb-EVs剂量呈正相关(r=0.9694, P<0.05)，并以剂量依赖方式诱导细胞释放产生IL-1β和IL-6(P<0.05)。结论 本研究建立了超滤浓缩法分离提取Mtb-EVs的技术流程，可得到形态完整、纯度较高、粒径分布集中的细胞外囊泡。同时，Mtb-EVs可以诱发DC胞内ROS水平上调，并以剂量依赖方式诱导细胞因子IL-1β和IL-6的释放。

• 单位
  基础医学院; 蚌埠医学院