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摘要
本实验室通过克隆拷贝肠膜状明串珠菌Leuconostoc mesenteroides 0326的右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase（EC 2.4.1.5）的基因dex-YG,构建右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌表达体系的工程菌。右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成高分子葡聚糖。本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG进行截短,受体结合相关位点的突变改造,对右旋糖酐蔗糖酶结构功能进行探究同时扩大其应用领域。以右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG为基础,通过生物信息的学比对分析,对其二级结构以及三级结构进行预测分析,对其C端序列进行一系列的截短,分析其结构功能的关系。通过片段截短的方法对其糖链延伸的控制,寡聚糖合成区域,以及完全保守区域进行了研究分析。对其末端重复序列删除,会极大的影响其合成葡聚糖的能力,截短片段长度增加,其合成高分子葡聚糖的能力急剧下降,在一定长度的截短后,其右旋糖酐的合成能力完全丧失。反应极大的偏向受体反应,从而起寡聚糖的合成能力显著提升,随着更进一步的片段截短直至其保守序列motif I,其受体反应的催化性能也极具下降,其酶活力几乎完全丧失。其中通过截短C-端1494 bp片段,得到剩余1-3087 bp基因片段的DSR-S1-△A突变酶。对其进行酶学性质研究表明,DSR-S1-△A酶在没有受体情况下,酶活完全丧失,受体存在时,DSR-S1-△A酶活是原始酶酶活的71.4%,其中糖基转移活性是水解活性的5.3倍,其主要活性为转糖基功能,多糖聚合能力低。通过用麦芽糖、纤维二糖、棉子糖和水苏糖等不同糖类和多个非糖类小分子为转糖基受体的转糖基研究表明:麦芽糖是该酶转糖基反应的最佳受体,同时对纤维二糖、棉子三糖和水苏糖都有活性,但转糖基依次减弱;不同天然低聚糖的转糖基反应都趋向于生成低分子量的糖,转移1-2个葡萄糖基到受体分子,并且受体分子量越小越易进行转糖基作用非碳水化合物小分子为受体底物;可利用Vc为转糖基受体进行转糖基反应,得到Vc葡萄糖衍生物,正在进行对其产物的进一步研究。此外本实验在之前对右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG二级三级预测分析的基础上,结合相关家族酶的目前的研究基础,在预测的受体结合位点进行突变改造,进一步探究此酶结构与转糖基功能间关系,以期得到对更多的非碳水化合物药用分子有转糖基作用的工程菌,从而制备药用分子的糖苷衍生物,改变其原来天然化合物的理化性质,提高生物利用度。目前已初步完成了突变体的构建和部分工程菌的筛选。综上,本研究明确了右旋糖酐蔗糖酶转糖基功能的分子区域,有助于进一步认识右旋糖酐蔗糖酶的催化机制;同时对于非碳水化合物药用分子的糖基化研究具有重要意义。
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