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摘要
右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成高分子葡聚糖,本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG进行系列分子截短,分析不同片段的右旋糖酐截短突变酶的特性,以探究右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系,揭示其催化机制;构建筛选得到具较高活性的突出转糖基的DSR突变酶,揭示其转糖基功能的关键区域;并对该突变酶的性质进行研究,同时利用突变后的转糖基酶对不同糖类受体和维生素C（Vc）进行糖基化,与原始酶进行分析比较,获得该突变酶对受体糖基化的催化规律。1、以右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG为基础,通过生物信息学的比对分析,对其二级结构以及三级结构进行预测分析,对其C端序列进行一系列的截短,分析其结构功能的关系。通过片段截短的方法对其糖链延伸的控制区,寡聚糖合成区域,以及完全保守区域进行了研究分析,探讨右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系。结果表明:对其末端重复序列进行删除,会极大的破坏右旋糖酐蔗糖酶合成葡聚糖的能力。随截短片段长度增加,其合成高分子葡聚糖的能力急剧下降,在蛋白367aa个氨基酸的截短后,其右旋糖酐的合成能力完全丧失,相对应的其受体反应的催化功能会明显增强,从而导致寡聚糖的合成能力显著提升。随着更进一步的片段截短直至其保守序列motifⅠ,其受体反应的催化性能也极具下降,其酶活力几乎完全丧失。2、通过分子截短获得的突变右旋糖蔗糖酶DSR-S1-AA,并对突变酶的表达条件进行优化。酶学性质研究发现:该酶最适pH均为5.4,pH稳定性均为4.4-7;最适温度均为25℃;DSR-S1-AA酶在没有受体情况下,酶活完全丧失;受体存在时,DSR-S1-AA酶活是原始酶酶活的71.4%,其中糖基转移活性是水解活性的5.3倍,DSR-S1-AA耐热性比原始酶有所下降,在30℃保藏1h酶活力只有20.8%。以麦芽糖为受体研究表明,受体浓度为200mM时酶活最高,供体蔗糖对DSR-S1-AA酶的影响较大,酶活随着蔗糖浓度提高而不断增加。结果显示DSR-S1-AA主要活性为转糖基功能,多糖聚合能力低,从而明确了DSR的转糖基功能区域。3、通过对麦芽糖、纤维二糖、棉子糖和水苏糖等不同糖类受体的转糖基研究,结果表明:麦芽糖是该酶转糖基反应的最佳受体,同时对纤维二糖、棉子三糖和水苏糖都有活性,但转糖基依次减弱;不同天然低聚糖的转糖基反应都趋向于生成低分子量的糖,转移1-2个葡萄糖基到受体分子,并且受体分子量越小越易进行转糖基作用,α键连接糖类化合物比β键连接糖类化合物更易进行转糖基反应;说明改造后的酶能利用更少的麦芽糖合成更多的低聚糖。综上,本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因的分子截短突变,探讨了右旋糖酐蔗糖酶结构区域与催化功能的关系,明确了右旋糖酐蔗糖酶转糖基功能的分子区域,有助于进一步认识右旋糖酐蔗糖酶的催化机制;同时对于功能低聚糖的制备和天然产物的糖基化研究具有重要意义。
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