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摘要
【目的】以临床分离的多重耐药鸡大肠埃希菌Inc FⅡ质粒为研究对象，探究核蛋白H-NS调控其接合转移的分子机制，为控制Inc FⅡ质粒介导的多重耐药基因水平散播提供理论依据。【方法】测定大肠埃希菌ATCC25922及4株重组菌(p BAD25922、F25922、FΔhns和FΔhns/phns)的生长曲线，比较hns对菌株的影响情况；分别以F25922、FΔhns和FΔhns/phns为供体菌，大肠埃希菌J53(耐叠氮钠)为受体菌，进行接合试验，并计算接合频率；采用实时荧光定量PCR检测各重组菌(F25922、FΔhns和FΔhns/phns)中Inc FⅡ质粒接合转移相关基因(tra M、tra J和tra Y)的m RNA表达量；构建Lac Z融合报告菌株F25922/PM(PJ/PY)、FΔhns/PM(PJ/PY)和FΔhns/phns/PM(PJ/PY)，分别测定不同菌株中3种基因(tra M、tra J和tra Y)启动子PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性；构建H-NS蛋白原核表达载体，采用镍离子亲和层析法分离纯化H-NS核蛋白，PCR扩增并纯化3种基因启动子区的DNA序列，利用电泳迁移率变动分析试验(EMSA)探明核蛋白H-NS调控Inc FⅡ质粒接合作用的调控方式，预测H-NS与不同启动子的结合位点并用EMSA进行进一步验证。【结果】重组菌F25922和p BAD25922与大肠埃希菌ATCC25922的生长状况无明显差异，说明质粒p BAD和Inc FⅡ均不影响宿主菌大肠埃希菌ATCC25922的生长；但是，缺失重组菌FΔhns和缺失回补重组菌FΔhns/phns的生长速度明显低于大肠埃希菌ATCC25922，表明hns的缺失导致菌株的生长适应性变差，但不影响菌株的存活。接合试验结果显示，FΔhns中Inc FⅡ质粒的接合频率较对照菌F25922升高了1 279.33倍(P<0.001)，而FΔhns/phns中Inc FⅡ质粒的接合频率虽未完全恢复到对照菌株的水平，但也明显低于FΔhns。实时荧光定量PCR结果显示，FΔhns中tra基因(tra M、tra J和tra Y)的m RNA表达量均极显著高于对照菌株(P<0.001)，其中tra J的m RNA表达量最高，为F25922的1 510.14倍，其次为tra Y和tra M，表达量分别为F25922的448.14倍和81.54倍，而回补株FΔhns/phns中不同基因的m RNA表达量均极显著低于FΔhns，与对照菌相类似。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示，缺失报告菌株FΔhns/PM(PJ/PY)中PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性分别为5.66,10.45和21.91，均极显著高于对照菌F25922/PM(PJ/PY)的相应启动子(P<0.001)，而回补报告菌株FΔhns/phns/PM(PJ/PY)中PM、PJ和PY的β-半乳糖苷酶活性极显著低于FΔhns/PM(PJ/PY)，且均与对照菌株无明显差异。这些结果均表明hns对Inc FⅡ质粒接合转移呈明显的负调控作用。EMSA结果显示，H-NS核蛋白均能明显阻滞3个tra基因启动子DNA的迁移，说明H-NS可直接与tra基因的3个启动子区结合；通过对结合位点的预测和EMSA进一步验证，证实H-NS核蛋白可与3个启动子区的AT富集区结合。【结论】H-NS核蛋白通过直接与Inc FⅡ质粒的tra M、tra J和tra Y的启动子区的AT富集区结合，抑制启动子活性，从而导致启动子下游相关转移基因tra M、tra J和tra Y的表达量下降，结果明显抑制Inc FⅡ质粒的接合转移。
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