奶牛RORα基因的生物信息学分析与组织表达谱检测

作者：刘薇; 王博; 王逢博; 张粉丽; 杨王浩; 赵泓淙; 高登科; 张海森; 李超; 靳亚平; 陈华涛^*

来源：基因组学与应用生物学, 2023, 42(01): 13-24.

DOI：10.13417/j.gab.042.000013

• 奶牛
• 表达谱
• RORα基因
• 生物钟
• 生物信息学分析

本研究旨在克隆奶牛(Bos taurus)维甲酸相关孤儿受体α (retinoic acid-related orphan receptor alpha,RORα)的蛋白编码序列(coding sequence, CDS),预测分析其结构与功能特征并验证其真核表达载体在HEK293T细胞中的过表达效果，进一步检测RORα基因在奶牛不同组织的表达谱。本研究提取了奶牛肝脏组织的总RNA,反转录得到cDNA,经过PCR扩增后获得奶牛RORα基因的CDS区片段，随后将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA线性化载体进行同源重组连接。转化感受态细胞DH5α后，对初步鉴定为阳性克隆的重组质粒进行测序。结合测序结果，利用ExPASy、 Protscale和DNAstar等生物信息学软件，对奶牛RORα蛋白的理化性质和功能特性进行预测分析。将对照组空质粒pcDNA3.1-Puro-N-3HA和试验组重组质粒pcDNA-3.1-3HA-RORα分别转染至HEK293T细胞，借助实时定量PCR和蛋白质印迹法检测奶牛RORα基因的过表达效果。借助半定量RT-PCR技术检测奶牛RORα基因在肝脏、脾脏和肌肉等7个组织的相对表达量。PCR结果显示，成功克隆了奶牛RORα基因的CDS区片段；酶切及测序结果表明重组质粒pcDNA3.1-3HA-RORα构建成功；生物信息学软件预测分析结果表明，奶牛RORα蛋白三级结构与山羊(Capra hircus)、小鼠(Mus musculus)的高度相似；不同物种间同源性比对显示，奶牛RORα基因与山羊的相似性最高；实时定量PCR和蛋白印迹法结果表明，与对照组相比，试验组HEK293T细胞中奶牛RORα基因的mRNA和蛋白表达水平均显著升高；半定量RT-PCR结果表明，在所检测的7个组织中，奶牛RORα基因在肝脏表达量最高，在脾脏表达量最低。本研究成功克隆了奶牛RORα基因的CDS区片段，在HEK293T细胞中验证了其真核表达载体在mRNA和蛋白水平的表达效果，并分析了其结构与功能特征，检测了其在不同组织的表达谱，为深入探究其在奶牛生殖与代谢调控中的作用机制提供了前期基础。

• 单位
  西北农林科技大学