AMPK通过调控mTOR/Nix信号通路参与小鼠肝缺血-再灌注损伤

作者：杜晨阳; 王振; 宋虎; 李世朋; 张海明; 张建军

来源：中国普外基础与临床杂志, 2017, 24(10): 1191-1199.

DOI：10.7507/1007-9424.201704050

• 缺血-再灌注损伤
• 线粒体自噬
• 腺苷酸活化蛋白激酶
• 机制
• 小鼠

目的探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)在肝脏缺血-再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)中的作用机制。方法 (1)分组。将42只小鼠随机分为假手术组(Sham组)、4个时点缺血-再灌注(IR)组(2、6、12及24 h)、Compound C组及Compound C+雷帕霉素(Rapa)组,每组6只小鼠。Compound C组:腹腔注射Compound C(25 mg/kg)1 h后,建模。Compound C+Rapa组:腹腔注射Rapa(1 mg/kg)和Compound C(25 mg/kg)1 h后,建模。4个时点IR组、Compound C组和Compound C+Rapa组小鼠制备HIRI模型。Sham组小鼠仅行开腹、游离第一肝门以及关腹操作。(2)IR最佳时点筛选。检测Sham组和4个时点IR组小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度,取肝组织行HE染色观察肝组织的病理学改变,并采用蛋白印迹法检测小鼠肝组织中自噬、凋亡相关蛋白的表达。综合血生化检测结果、HE染色结果和蛋白印迹实验结果确定IR最佳观察时点。(3)AMPK机制研究。取IR-12 h组、Compound C组(建模后12 h)和Compound C+Rapa组(建模后12 h)小鼠肝脏组织,行免疫组化染色观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,行罗丹明123染色观察线粒体损伤情况,行蛋白印迹实验检测自噬、凋亡相关蛋白的表达,行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL法)检测肝脏细胞的凋亡情况。结果 (1)IR后12 h为最佳观察时点。与IR-12 h组比较,Sham组,IR-2、6及24 h组的ALT和AST浓度均较低(P<0.05);HE染色结果示IR-12 h组小鼠的肝组织结构破坏最为严重;蛋白印迹实验结果示,与IR-12 h组比较,Sham组,IR-2、6及24 h组的AMPKα、磷酸化型腺苷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)、Nip3样蛋白X(Nix)及BCL-2同源的水溶性相关蛋白(Bax)的表达水平,以及自噬微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ比值均较低(P<0.05),而磷酸化型哺乳动物Rapa靶蛋白(p-mTOR)的表达水平均较高(P<0.05)。因此IR 12 h为最佳观察时点。(2)与IR-12 h组比较,Compound C组小鼠肝组织中PCNA的表达水平较低(P<0.05),线粒体发光强度较弱,凋亡细胞较多;与Compound C组比较,Compound C+Rapa组小鼠肝组织中PCNA的表达水平较高(P<0.05),线粒体发光强度较强,凋亡细胞较少。(3)与IR-12 h组比较,Compound C组小鼠肝组织中Nix及p-AMPKα的表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低(P<0.05),而p-mTOR、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)及分裂型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)的表达水平均升高(P<0.05);与Compound C组比较,Compound C+Rapa组小鼠肝组织中p-AMPKα和Nix的表达水平均升高(P<0.05),而p-mTOR、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表达水平均降低(P<0.05)。结论在小鼠HIRI过程中,AMPK通过m-TOR/Nix通路调节线粒体自噬和凋亡。

• 单位
  天津市第一中心医院; 焦作市人民医院