烟曲霉纤维二糖水解酶cbh基因在大肠杆菌中的表达

作者：杨海峰; 魏亚琴; 杨宇泽; 万学瑞; 孙康永杰; 成述儒^*; 王川^*

来源：草业科学, 2020, 37(12): 2457-2462.

• 烟曲霉
• 纤维素
• 纤维素酶
• 纤维二糖水解酶
• 大肠杆菌
• 酶活
• 克隆与表达

为构建高效表达的纤维素酶基因工程菌,本研究以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)基因组DNA为模板,通过PCR扩增出纤维二糖水解酶cbh (cellobiohydrolase)基因,将其连接到原核生物表达载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21 (DE3)中诱导表达蛋白CBH (cellobiohydrolase),同时采用刚果红染色、3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic, DNS)法测定重组菌株酶活力。结果表明:成功构建表达载体pET-28a::cbh,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopro-pyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)终浓度为1 mmol·L-1,诱导温度为28℃,诱导时间为14 h,纯化后的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)得到一条75 kDa的目的蛋白,通过羧甲基纤维素钠(carboxymethyl cellulose-Na, CMC-Na)刚果红平板检测到pET-28a::cbh/E.coli可以产生水解圈,表明获得的重组菌株具有酶活性,其酶活力为0.056 3 U·mL-1。本研究构建的重组纤维素酶菌株,可为改善牧草青贮品质和提高反刍动物生产性能奠定研究基础。

• 单位
  甘肃农业大学; 甘肃省科学院生物研究所