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摘要
目的 探讨Runx2基因是否具有体外诱导人羊膜MSCs(human amniotic MSCs,hAMSCs)向韧带成纤维细胞分化以及在体内能否促进兔前交叉韧带重建后腱-骨愈合。方法 取健康产妇自愿捐赠胎盘分离培养hAMSCs并传代后行流式细胞鉴定。构建携带Runx2基因的腺病毒载体（Ad-Runx2）以及空质粒载体腺病毒（Ad-NC），经病毒滴度测定后分别转染第3代hAMSCs(Ad-Runx2组、Ad-NC组)，实时荧光定量PCR及Western blot检测Runx2基因及蛋白表达，验证Ad-Runx2基因转染hAMSCs有效性；然后于转染后培养3、7 d时，进一步采用实时荧光定量PCR检测韧带成纤维细胞相关基因[VEGF、Ⅰ型胶原、纤连蛋白（Fibronectin）和肌腱蛋白C(Tenascin-C)]表达；以单纯hAMSCs作为空白对照组。将单纯hAMSCs以及转染Ad-NC、AdRunx2的hAMSCs分别与基质胶（Matrigel）按照体积比1∶1和1∶2混合构建复合物，采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖，取增殖较好的对应复合物进行后续动物实验。将12只新西兰白兔随机分为假手术组（Sham组）、前交叉韧带重建组（ACLR组）、前交叉韧带重建+Ad-NC组（Ad-NC组）、前交叉韧带重建+Ad-Runx2组（Ad-Runx2组）4组，每组3只。制备前交叉韧带重建模型后，Ad-NC组、Ad-Runx2组于骨道内对应注射最佳hAMSCs-Matrigel复合物。术后1个月取材行大体、组织学（HE染色及天狼猩红染色）、免疫荧光染色观察，评价韧带组织中炎症细胞浸润以及Ⅰ/Ⅲ型胶原、Tenascin-C含量。结果 流式细胞鉴定分离培养细胞符合MSCs表型特征。Runx2基因成功转染至hAMSCs；与Ad-NC组相比，Ad-Runx2组转染后VEGF及Ⅰ型胶原基因相对表达量于培养3、7 d时均增高（P<0.05）,Fibronectin仅3 d时增高（P<0.05），而Tenascin-C于3 d时增高、7 d时降低（P<0.05）。CCK-8检测示两种比例混合培养后，细胞增殖组间以及组内各时间点间差异均无统计学意义（P>0.05），选择1∶1比例构建复合物进行后续实验。动物实验显示，术后1个月时，大体观察各组移植肌腱连续性完整；HE染色示Ad-Runx2组组织修复情况优于ACLR组和Ad-NC组、炎症细胞更少；天狼猩红染色及免疫荧光染色均示Ad-Runx2组韧带组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维增多，趋于形成正常前交叉韧带结构，但Tenascin-C蛋白荧光强度与ACLR组和Ad-NC组相比减弱。结论 Runx2基因转染hAMSCs后可诱导其向韧带成纤维细胞定向分化，并促进兔前交叉韧带损伤重建的腱-骨愈合。
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