舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

作者：刘礼辉; 胡蕾; 杨圆圆; 方伟; 林强; 付小哲; 梁红茹; 赵永亮; 李宁求^*

来源：西北农林科技大学学报(自然科学版), 2019, 47(08): 17-24.

DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2019.08.003

• 舒伯特气单胞菌
• rpoD基因
• 实时荧光定量PCR

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。

• 单位
  华中农业大学; 广东省水生动物疫病预防控制中心; 农业部; 生命学院; 中国水产科学研究院珠江水产研究所; 上海海洋大学