人烯醇化酶1在原核细胞中的可溶性表达及纯化

作者：金科华; 向念慈; 刘洋

来源：湖北科技学院学报(医学版), 2022, 36(05): 405-412.

DOI：10.16751/j.cnki.2095-4646.2022.05.0405

• 烯醇化酶1
• 表达
• 纯化
• 原核细胞
• 可溶性

目的 用原核表达系统生产人烯醇化酶1(ENO1),为筛选抑制剂奠定基础。方法 通过5′分别带Nde I和Xho I位点的一对引物PCR扩增ENO1 cDNA,用Nde I+Xho I酶切cDNA和质粒pET-28a。酶切产物经纯化后用T4 DNA ligase连接，并转化大肠杆菌Top10,用含卡那霉素的LB平板(LBK培养基)筛选转化子。提取转化子质粒，酶切和测序法鉴定。将序列正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用LBK培养基培养抗性菌落至OD600约为0.7,加入终浓度0.2mmol/L IPTG,16℃诱导ENO1表达20h。超声破碎收集的菌体离心取上清，用组氨酸标签蛋白(可溶性)纯化试剂盒纯化ENO1。对纯化的ENO1进行超滤浓缩和缓冲液交换后，BCA法测定浓度，低温保存。结果 ENO1正确连入pET-28a,重组菌pET-28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导后，从裂解液上清中获得了高纯度的ENO1,产量达427mg/L。结论 高产量、高纯度可溶性ENO1奠定了抑制剂筛选模型建立的基础。

• 单位
  基础医学院; 湖北科技学院