猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

作者：张记宇; 韩郁茹; 时洪艳; 陈建飞; 张鑫; 刘建波; 张燎原; 冯书风; 冯廷帅; 季朝阳; 石达; 冯力

来源：畜牧兽医学报, 2021, 52(10): 2887-2894.

• 猪急性腹泻综合征病毒
• N基因
• 荧光定量PCR
• 检测

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10~1～3.31×10~7拷贝·μL~(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10~1拷贝·μL~(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12～36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10~(6.7)、10~(5.3)拷贝·mL~(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。

• 单位
  兽医生物技术国家重点实验室; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所