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摘要
目的:探讨沉默KDM5A基因表达对卵巢上皮癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP耐药性的影响及其机制。方法:选择高表达KDM5A的SKOV3/DDP细胞,设计KDM5A基因靶向的发夹状shRNA,筛选出最佳shRNA沉默片段,构建携带有目的基因的重组慢病毒干扰载体并感染SKOV3/DDP细胞,通过嘌呤霉素筛选,RT-PCR和Western blot法验证,建立稳定干扰KDM5A表达的细胞株SKOV3/DDP-KDM5Ai。将实验分为3组,即KDM5A沉默组(SKOV3/DDP-KDM5Ai)、阴性对照组(SKOV3/DDP-NC)和空白对照组(SKOV3/DDP),流式细胞仪检测细胞的周期比例及凋亡情况; CCK-8法检测细胞的IC50;高效液相色谱分析法检测在不同质量浓度(7.5μg/ml和15μg/ml)顺铂作用48h后细胞内的药物浓度。RT-PCR技术和Western blot法细胞中β-catenin、P-gp及COX-2的mRNA和蛋白表达水平。结果:成功建立KDM5A基因表达沉默的SKOV3/DDP细胞株。SKOV3/DDP-KDM5Ai组细胞凋亡率增高,G0/G1期细胞比例明显增高,而S期和G2期细胞比例明显下降,与SKOV3/DDP-NC组及SKOV3/DDP组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。SKOV3/DDP-KDM5Ai组细胞、SKOV3/DDP-NC组细胞及SKOV3/DDP组细胞对顺铂的IC50分别为(17.5847±1.1482)μg/ml、(27.8587±0.8876)μg/ml、(28.1267±0.7308)μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3/DDP-KDM5Ai组在不同顺铂质量浓度(7.5μg/ml和15μg/ml)下细胞内顺铂浓度均明显高于SKOV3/DDP-NC组及SKOV3/DDP组(F=5.14,P<0.01)。RT-PCR技术和Western blot法显示,SKOV3/DDP-KDM5Ai组的β-catenin、P-gp及COX-2的mRNA和蛋白表达水平明显低于SKOV3/DDP-NC组及SKOV3/DDP组(P<0.05)。结论:KDM5A基因在顺铂耐药卵巢癌细胞中高表达,其沉默后可在体外降低顺铂耐药的卵巢癌SKOV3/DDP细胞的耐药性,其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。
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单位广西医科大学; 湖北省妇幼保健院
