FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变

作者：程鹏飞; 林佳; 唐景峰

来源：中国生物制品学杂志, 2014, 27(08): 1086-1091.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.000512

• 荧光定量PCR
• 结直肠癌
• 基因突变
• 测序

目的建立实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)联合Sanger测序法快速检测结直肠癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、KRAS和BRAF基因突变的方法。方法根据结直肠癌中EGFR、KRAS和BRAF基因常见突变类型设计引物及其TaqMan探针序列,以提取的86份结直肠癌患者肿瘤组织DNA为模板,进行FQ-PCR扩增,PCR产物经SAP酶和EXOⅠ酶作用后,收集酶切产物,进行测序PCR扩增,扩增产物经乙醇/醋酸钠法纯化后进行测序,测序结果采用Bioedit软件进行分析;检测EGFR、KRAS及BRAF基因突变,并与FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变进行比较。结果成功建立了FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者样本中EGFR、KRAS和BRAF基因突变的方法,各基因PCR扩增曲线均为标准的"S"型荧光扩增曲线,测序峰图清晰、稳定。86份结直肠癌样本中,EGFR基因突变概率2.3%(2/86),均为第21号外显子点突变,突变类型为L858R和L861Q;KRAS基因突变概率33.7%(29/86),其中第12位密码子突变占79.3%(23/29),突变类型为G12D和G12V,第13位密码子突变占10.3%(3/29),突变类型为G13D,第12和13位密码子同时突变1例(3.4%),第61位密码子未检测到突变,第146位密码子仅检测到2例突变,占6.9%(2/29),突变类型均为A146V;BRAF基因未检测到突变。FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变概率高于FQ-PCR联合Sanger测序法,但差异无统计学意义(P>0.05),两种检测方法的总体符合率为97.7%(84/86)。结论实时FQ-PCR联合Sanger测序法可快速检测结直肠癌患者中EGFR、KRAS和BRAF基因突变,检测方法稳定、可靠。

• 单位
  病毒学国家重点实验室; 武汉大学