腺苷激酶小干扰RNA修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞的增生和分泌

作者：张万红^*; 焦惠英; 阮燕飞; 刘元真

来源：中华实验眼科杂志, 2019, (05).

• 腺苷激酶
• 角膜移植
• 内皮细胞
• 调节性T细胞

目的 探讨腺苷激酶(ADK)小干扰RNA(siRNA)修饰的角膜内皮细胞诱导调节性T细胞(Treg)增生和分泌的作用。方法 取第3～5代人角膜内皮细胞,实验分为转染组和未转染组,转染组采用Lipofectamine? 3000将FAM-ADK siRNA转染进入角膜内皮细胞,采用高效液相色谱法检测各组中腺苷的质量浓度。实验分为对照组[转染对照siRNA]、雷帕霉素组(转染对照siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素)和ADK siRNA组(转染ADK siRNA后培养液中加入10 ng/ml雷帕霉素),采用TUNEL染色检测细胞凋亡比例；采用流式细胞术检测内皮细胞表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和E-选择素的表达。实验分为单独培养组(单纯淋巴细胞培养)、共培养组(淋巴细胞与角膜内皮细胞共培养)和ADK siRNA组(淋巴细胞与ADK siRNA转染的角膜内皮细胞共培养),流式细胞术检测各组CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞的比例；ELISA法检测各组上清液中白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的质量浓度。结果 流式细胞术检测结果显示,95.1%的角膜内皮细胞表达siRNA,转染组上清液中腺苷的质量浓度为(38.020±6.658)ng/ml,较对照组的(1.663±0.581)ng/ml明显升高,差异有统计学意义(t＝5.437,P＝0.006)。TUNEL染色结果显示,雷帕霉素组角膜内皮细胞平均凋亡率较对照组明显升高,ADK siRNA组角膜内皮细胞平均凋亡率较雷帕霉素组明显降低,差异均有统计学意义(t＝3.763,P＝0.020；t＝4.405,P＝0.012)。流式细胞术检测结果显示,ADK siRNA组ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的平均荧光强度分别为4.060±1.179、3.600±1.234和5.223±1.734,明显弱于对照组的11.600±2.427、11.030±2.291和24.270±4.332,差异均有统计学意义(t＝2.794,P＝0.049；t＝2.857,P＝0.046；t＝4.081,P＝0.015)。单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞比例总体比较,差异有统计学意义(F＝12.890,P＝0.007),其中ADK siRNA组淋巴细胞中Treg细胞的比例较共培养组明显升高,差异有统计学意义(t＝3.650,P＝0.022)。ELISA检测结果显示,单独培养组、共培养组和ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度总体比较,差异均有统计学意义(F＝20.960,P＝0.003；F＝27.320,P＝0.001),其中ADK siRNA组淋巴细胞上清液中IL-10和TGF-β的质量浓度均较共培养组明显升高,差异均有统计学意义(t＝4.492,P＝0.011；t＝5.280,P＝0.006)。结论 ADK siRNA修饰的角膜内皮细胞能够诱导Treg细胞增生及分泌IL-10和TGF-β,为角膜移植的免疫耐受诱导提供了新的选择。

• 单位
  南阳市中心医院; 天津市泰达医院