P4501A1基因Thr~(461)→Asn~(461)及Ile~(462)→Val~(462)突变载体的构建

作者：魏青; 刘**; 王辉; 招小林; 任铁玲; 肖勇梅

来源：卫生研究, 2006, (05): 540-542.

DOI：10.3969/j.issn.1000-8020.2006.05.004

• 定点突变
• CYP1A1
• 测序分析

目的构建P4501A1基因cDNAThr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体,为进一步研究CYP1A1的功能和致癌机制奠定基础。方法根据人CYP1A1基因(GeneBankNM-000499)cDNA序列设计通用引物Pm3/Pm4和突变引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,内含酶切位点和突变位点,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18组成两对引物,以pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第一轮扩增,获得上游1397bp片断,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4组成两对引物以10ngpGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第二轮扩增,得到下游177bp片断。然后用Pm3/Pm4做引物以第一、第二轮扩增产物为模板进行第三轮扩增,获得的1·5kb扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离并回收纯化,将纯化的PCR产物与pMD-T载体连接后转化大肠埃希菌DHα5感受态细胞,挑单克隆扩增、质粒抽提后进行酶切和测序鉴定。结果三轮PCR扩增得到的1·5kb片断,经内切酶BamHI和SalI消化和T7p和SP6通用引物进行双向测序,证实克隆的目的片段与GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性为99·9%,且包含两个设计的突变位点Asn461、Val462。结论本实验成功地构建了含突变位点Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片断。

• 单位
  中山大学公共卫生学院