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摘要
目的构建含有RagB的重组慢病毒表达载体,实现RagB基因在C2C12细胞中过表达,并检测熊果酸对该细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)活性的调节作用。方法使用Flag p LJM1 RagBWT、Flag p LJM1RagB54L和Flag p LJM1 RagB99L慢病毒载体作为模板,PCR扩增Flag-RagBWT、Flag-RagB54L和Flag-RagB99L,然后将其亚克隆到p WPI载体的Swa I酶切位点之中,进行菌液PCR鉴定;将克隆好的p WPI-RagBWT、p WPI-RagB54L和p WPIRagB99L质粒和病毒包装质粒ps PAX2、p MD2.G按相应的比例转染到293T细胞中,48 h后收集上清液感染C2C12细胞,实现RagB基因在C2C12细胞中过表达;使用亮氨酸和熊果酸单独或共同处理RagB99L过表达的C2C12细胞,Western blot检测m TOR活性。结果使用上清液感染C2C12细胞,荧光显微镜显示感染效率接近100%,Western blot证实RagB蛋白表达明显增高;熊果酸显著抑制RagB99L过表达细胞中m TOR活性。结论通过构建慢病毒载体实现RagB基因在C2C12细胞中过表达,RagB在熊果酸抑制m TOR活性中具有关键作用。
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