贵州黑山羊COL1A1基因真核表达载体构建及其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔基因的影响

作者：周明帅; 温晓艳; 陆情梅; 刘彬; 杨永鲜; 赵佳福^*

来源：南方农业学报, 2023, 54(01): 261-272.

• 贵州黑山羊
• COL1A1基因
• 细胞外基质
• 卵巢颗粒细胞
• 产羔性状

【目的】构建I型胶原蛋白α1链基因（COL1A1）过表达载体，并分析其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔相关基因的影响，为后续深入研究COL1A1基因影响山羊产羔性状的分子机制打下基础。【方法】通过重叠延伸PCR克隆COL1A1基因A和B片段，然后分别重组连接至pUC57和pcDNA3.1（+）线性化载体上，再通过酶切连接获得COL1A1基因全长，构建pcDNA3.1(+)-COL1A1过表达载体；转染山羊卵巢颗粒细胞后，通过Western blotting检测COL1A1蛋白表达效率，采用免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位情况，并以实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因[骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基（FSHB）]表达的影响。【结果】COL1A1基因全长环化质粒检测大小为1847 bp，连接至pcDNA3.1（+）线性化载体上成功构建获得COL1A1基因过表达载体。Western blotting检测结果表明，pcDNA3.1(+)-COL1A1转染颗粒细胞48 h后，COL1A1蛋白表达量极显著高于pcDNA3.1（+）空载体转染组（P<0.01，下同）；免疫荧光检测结果表明，COL1A1蛋白在颗粒细胞细胞核及细胞质中均有表达，但在细胞核中的表达水平更高；实时荧光定量PCR检测结果表明，pcDNA3.1(+)-COL1A1转染组颗粒细胞中COL1A1、COL2A1和COL3A1胶原蛋白家族基因及GDF9、FSHB和BMP15产羔相关基因的相对表达量极显著高于pcDNA3.1（+）空载体转染组，但对BMPR1B基因的表达无显著影响（P>0.05）。【结论】COL1A1基因在卵巢颗粒细胞中广泛表达，其过表达能极显著促进胶原蛋白家族基因COL2A1和COL3A1及产羔相关基因GDF9、FSHB和BMPR1B在颗粒细胞中的表达，即COL1A1基因可协同胶原蛋白家族基因的表达促进ECM合成来影响卵巢组织结构、胚胎发育及促进性腺激素表达，进而影响山羊产羔性状，可作为影响贵州黑山羊多羔候选基因进行深入研究。

• 单位
  贵州大学; 动物科学学院