Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体

作者：张雨晴; 刘毅; 张旭霞; 李传友

来源：国际呼吸杂志, 2018, 38(06): 435-440.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2018.06.008

• 印迹法,蛋白质
• Gibson Assembly
• 同源重组
• 标签蛋白
• 原核类泛素蛋白

目的体外构建表达原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸(his6)和链霉素(strep)标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段;应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体pET28a-his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌(E.coli)和耻垢分枝杆菌(M.sm)中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳,用免疫印迹法(Western blot)验证标签蛋白在E.coli和M.sm中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Western blot结果表明标签蛋白在E.coli和M.sm中均可得到正确表达,在M.sm中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

• 单位
  首都医科大学附属北京胸科医院; 北京市结核病胸部肿瘤研究所