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摘要
【目的】原核表达Bcl-x L蛋白的突变体PTD-FNK蛋白,为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物,以p ET-28a(+)-PTD-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增两段突变序列;回收PCR产物片段进行Dpn I消化,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导融合蛋白表达,探索IPTG诱导表达的适宜温度,最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp,经Dpn I消化后进行重组反应,再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建p ET-28a(+)-PTD-FNK质粒。在30℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白,以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白,且诱导时间短,无须复性,有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。
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