科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
本研究之目的为建立一种新型的筛选碳青霉烯酶NDM-1抑制剂的ELISA方法，该方法基于细菌青霉素结合蛋白（PBP）与碳青霉烯药物完整结构和水解产物的亲和力差异极大的原理。其基本步骤为：BSA与美罗培南的偶联物（BSA-MEM）包被于ELISA板封闭后，将待筛化合物与NDM-1蛋白同时加入反应，随后加入生物素标记的PBP蛋白（PBP-BIO），PBP-BIO可与未被水解的BSA-MEM进行结合，通过生物素-链霉亲和素系统产生的信号来表征结合的PBP蛋白以及未被水解的BSA-MEM的量，从而间接指征待筛化合物对NDM-1是否有抑制活性。通过原核表达系统，表达纯化碳青霉烯酶NDM-1，利用EDC偶联法和生物素标记法，制备BSA-MEM和PBP-BIO的偶联物，采用棋盘滴定法确定BSA-MEM量、NDM-1、待筛化合物和PBP-BIO的最佳工作浓度和反应时间等参数，并利用该方法对FDA批准药物库中的300余种化合物进行初步筛选。结果显示，最佳ELISA方案为：BSA-MEM偶联物包被量为1 μg，100 μL/孔；封闭液为1%的牛血清白蛋白，作用时间为2 h；NDM-1使用量为4 μg；待筛化合物的使用浓度为30 μmol/L，反应时间为15 min；PBP-BIO稀释度为1︰1 000，反应时间为15 min；SA-HRP作用时间为30 min，稀释度为1:3 000；TMB显色时间为15 min。利用上述建立的ELISA方法，成功从FDA批准药物库中筛选到两个潜在的NDM-1抑制剂。本研究成功建立了一种新型的NDM-1抑制剂的ELISA筛选方法，具有快速和高通量的优点，为NDM-1抑制剂的筛选提供了新方法和新思路。
- 单位
