摘要
本研究之目的为建立一种新型的筛选碳青霉烯酶NDM-1抑制剂的ELISA方法,该方法基于细菌青霉素结合蛋白(PBP)与碳青霉烯药物完整结构和水解产物的亲和力差异极大的原理。其基本步骤为:BSA与美罗培南的偶联物(BSA-MEM)包被于ELISA板封闭后,将待筛化合物与NDM-1蛋白同时加入反应,随后加入生物素标记的PBP蛋白(PBP-BIO),PBP-BIO可与未被水解的BSA-MEM进行结合,通过生物素-链霉亲和素系统产生的信号来表征结合的PBP蛋白以及未被水解的BSA-MEM的量,从而间接指征待筛化合物对NDM-1是否有抑制活性。通过原核表达系统,表达纯化碳青霉烯酶NDM-1,利用EDC偶联法和生物素标记法,制备BSA-MEM和PBP-BIO的偶联物,采用棋盘滴定法确定BSA-MEM量、NDM-1、待筛化合物和PBP-BIO的最佳工作浓度和反应时间等参数,并利用该方法对FDA批准药物库中的300余种化合物进行初步筛选。结果显示,最佳ELISA方案为:BSA-MEM偶联物包被量为1 μg,100 μL/孔;封闭液为1%的牛血清白蛋白,作用时间为2 h;NDM-1使用量为4 μg;待筛化合物的使用浓度为30 μmol/L,反应时间为15 min;PBP-BIO稀释度为1︰1 000,反应时间为15 min;SA-HRP作用时间为30 min,稀释度为1:3 000;TMB显色时间为15 min。利用上述建立的ELISA方法,成功从FDA批准药物库中筛选到两个潜在的NDM-1抑制剂。本研究成功建立了一种新型的NDM-1抑制剂的ELISA筛选方法,具有快速和高通量的优点,为NDM-1抑制剂的筛选提供了新方法和新思路。
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