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摘要
目的探讨miR-224-5p对前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)表达及对HepG2细胞摄脂能力的影响。方法运用生物信息学方法对miR-224-5p基因位置、保守性、种子序列进行分析。在Targetscan、miRanda、miRDB、RNAhybrid等多个数据库分析miR-224-5p与PCSK9结合位点及结合自由能。双荧光素酶报告基因验证miR-224-5p与PCSK9 mRNA 3′UTR直接靶向结合。Western blot检测miR-224-5p模拟物和miR-224-5p抑制剂对PCSK9和低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的影响。细胞免疫荧光直接观察细胞膜上的LDLR。油红O染色和DiI-LDL分别观察miR-224-5p对HepG2细胞脂滴含量和脂质摄取能力的影响。结果生物信息学分析发现人的miR-224-5p基因定位于Xq28,不同物种间高度保守。miR-224-5p与PCSK9 mRNA 3′UTR存在靶向结合的基础,结合自由能较低。双荧光素酶报告基因显示,miR-224-5p模拟物能抑制PCSK9-WT 3′UTR荧光素酶活性,而对PCSK9-Mut 3′UTR没有抑制作用,表明PCSK9 mRNA 3′UTR是miR-224-5p的靶点。进一步实验发现miR-224-5p模拟物能够明显抑制PCSK9蛋白表达,增加LDLR蛋白含量。miR-224-5p下调后则表现为PCSK9表达增加,细胞LDLR水平降低。此外,油红O染色可见miR-224-5p模拟物组HepG2细胞内的脂滴明显减少,而miR-224-5p抑制剂组HepG2细胞内的脂滴明显增多。miR-224-5p高表达后明显促进HepG2细胞对LDLC的摄取。结论 miR-224-5p靶向结合PCSK9 mRNA 3′UTR,抑制PCSK9表达,进而降低HepG2细胞内脂滴含量,增加HepG2细胞对脂质的摄取。
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