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摘要
研究背景：糖尿病是以胰岛素分泌缺乏、胰岛素抵抗或两者兼有，而致高血糖为特征的一种常见的多发的内分泌代谢性疾病。糖尿病并发症的发病机制一直是研究热点，氧化应激是糖尿病并发症的重要发病机制之一。活性氧(ROS)产生增多的同时，糖尿病还可以影响清除自由基的各种抗氧化酶的活性及表达，干扰和灭活NO，导致NO生物利用度降低，引起内皮功能不全，从而引起靶器官的损害。此外，晚期糖基化终末产物(AGE)及其受体(RAGE)在糖尿病并发症的病理过程中起主要作用。RAGE与AGE结合后活化，以及它的下游信号及随后的氧化应激反应和促炎症反应，促进了糖尿病并发症的发生和发展。糖尿病状态下，AGE表达增强，可以通过激活糜酶旁路促进组织AngⅡ产生，提示AGE能促进局部组织AngⅡ产生增多参与靶器官损害，而RAS系统的过渡激活能进一步提高AGE-RAGE系统的活性。缬沙坦作为AT1受体拮抗剂，可延缓2型糖尿病患者糖尿病肾病的发展，并且该作用得益于AT1受体拮抗剂降压以外的保护作用。此外，缬沙坦有逆转糖尿病心肌病大鼠心肌间质纤维化的作用。但目前对缬沙坦是否可延缓糖尿病脑病的发生和发展尚不清楚。鉴于(1)AGE及其RAGE在糖尿病的肾病等并发症中发挥重要作用；(2)体外研究显示抗氧化治疗能够抑制RAGE表达，提示氧化应激能促进AGE及其RAGE；(3)AT1受体拮抗剂能抑制糖尿病大鼠肾脏AGE及其RAGE表达，并能明显改善肾功能；(4)AT1受体拮抗剂对血管内皮有保护作用。为此，我们设计该课题：选用糖尿病大鼠模型，应用缬沙坦干预，采用Wastern blot、荧光实时定量RT-PCR、免疫组织化学、比色法等方法，观察研究糖尿病大鼠脑组织中AGE-RAGE系统、氧化应激、内皮功能的变化以及缬沙坦对以上指标的影响。目的：(1)探讨糖尿病时大鼠脑组织氧化应激、内皮功能的改变。(2)探讨AGE与RAGE系统在糖尿病脑病进程中的作用。(3)缬沙坦对糖尿病脑病的保护作用及机制探讨。方法：实验动物选取8周龄36只清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重180～200g，(购于山东大学实验动物中心)，随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病缬沙坦治疗组(DM.V组)，每组12只。模型制备：将DM组及DM.V组大鼠禁食10h后给予一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ，60mg／kg，溶于0.1 mol／L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中pH4.4，浓度1％)，NC组仅给予等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后，尾静脉取血，检测血糖≥16.7mmol／L为模型建立标准。缬沙坦干预方法：对DM.V组在检测模型成功1天后给予缬沙坦40mg／(kg·d)，共12周灌胃。NC组、DM组予相应体积的蒸馏水灌胃。实验期间动物给予正常饮食，每2周检测一次血糖。12周后进行如下检测：1．测定各组体重、血糖、收缩压；2．通过Morris水迷宫实验观察大鼠认知功能改变情况；3．比色法测定脑组织中羟自由基(OH)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；4．荧光实时定量RT-PCR法检测还原型辅酶Ⅱ(NADPH)p47phox mRNA、内皮素-1(ET-1)mRNA、NF-κB mRNA表达5．免疫组化检测脑组织AGE的表达；6．Wastern blot检测NF-κB、RAGE的表达。结果：1．处理12周后大鼠体重、血糖和收缩压测量DM组和DM.V组体重明显轻于NC组(均P＜0.01)，血糖明显高于NC组(均P＜0.01)，DM组与DM.V组间无显著差异(P＞0.05)。DM组收缩压较NC组和DM.V组升高约30mmHg(P＜0.01)，DM.V组与NC组大鼠收缩压比较无明显差异(P＞0.05)。2．Morris水迷宫实验结果DM组、DM.V组逃避潜伏期较NC组明显延长(均P＜0.01)，DM.V组较DM组明显缩短(P＜0.01)。3．OH~-、NO、MDA含量、SOD及GSH-Px活性检测结果与NC组比较，DM组OH~-、MDA水平显著升高，而NO含量、SOD及GSH-Px活性显著降低(均P＜0.01)；与DM组比较，DM.V组OH~-、MDA水平显著降低，而NO含量、SOD及GSH-Px活性显著升高(均P＜0.01)。4．脑组织ET-1、NADPH氧化酶p47phox、NF-κB的mRNA表达检测DM组ET-1、NADPH氧化酶p47phox和NF-κB的mRNA表达较NC组显著上调，分别达NC组的6.52、4.89及7.16倍，有明显差异(均P＜0.01)；DM.V组上述指标的mRNA表达分别达NC组的为2.29、2.67及1.80倍，差异有统计学意义(P＜0.05)；与DM组比较，DM.V组上述指标mRNA表达的抑制率分别为35％、54.5％及25％，差异有统计学意义(P＜0.05)。5．各组大鼠海马HE染色HE染色显示NC组大鼠海马CA1区锥体细胞形态规则，排列整齐，数量丰富，核膜清晰，核仁明显；DM组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紊乱、松散，核固缩，数量较NC组减少；治疗组锥体细胞数量介于两者之间，排列较整齐，神经元形态结构接近正常并且明显减轻了海马部分细胞核固缩现象。6．免疫组化检测NC组大鼠海马CA1区可见AGE在细胞膜及胞浆表达，且表达较弱；DM组大鼠海马CA1区AGE表达呈强阳性，阳性细胞呈棕褐色；与DM组相比较，DM.V组AGE表达强度减弱，阳性细胞数减少。图像分析结果示：DM组AGE的表达指数明显高于NC组(P＜0.01)；与DM组表达指数相比，DM.V组AGE的表达降低(P＜0.01)。7．Wastern blot检测结果DM组和DM.V组RAGE的蛋白表达水平较NC组升高，分别为NC组的1.79倍(P＜0.01)、1.23倍(P＞0.05)；与DM组相比，DM.V组RAGE的蛋白表达水平下降，为DM组的68.6％(P＜0.01)，有明显差异。DM组和DM.V组NF-κB的蛋白表达水平较NC组升高，分别为NC组的1.76倍(P＜0.01)、1.24倍(P＜0.05)；与DM组相比，DM.V组NF-κB的蛋白表达水平下降，为DM组的70.5％(P＜0.01)，有明显差异。结论：1．糖尿病脑组织中的NADPH氧化酶的活性明显上调，使ROS产生增多，抗氧化酶的活性降低，氧化应激水平提高；2．糖尿病可能促进AGE及RAGE的表达，AGE与RAGE结合促进氧化应激水平提高及NF-κB活化，氧化应激水平增高，进一步促进AGE与RAGE生成，打破NO与ET-1间的相对平衡，引起内皮功能的损伤，提示AGE-RAGE通路激活、氧化应激水平提高和内皮功能的损伤是糖尿病脑组织损伤的重要机制；3．缬沙坦通过阻断AngⅡ与AT1受体结合，一方面可能抑制NADPH氧化酶活性，降低脑组织氧化应激水平，继而减少AGE和RAGE表达，AGE-RAGE结合减少反过来又能降低氧化应激水平，减轻炎性反应，促进NO生成，减少ET-1的表达，促进内皮功能恢复；另一方面，氧化应激水平降低可能直接抑制NF-κB的表达，促进NO与ET-1间相对平衡的恢复，改善内皮功能及脑细胞损伤，逆转认知功能，延缓糖尿病脑病的进展。意义：本课题通过运用Wastern blot、荧光实时定量RT-PCR、免疫组织化学、比色法等方法，观察了缬沙坦干预前后糖尿病大鼠脑组织中AGE、RAGE、NF-κB、NADPH及ET-1、OH~-、NO、MDA、SOD、GSH-Px表达的变化以及大鼠逃避潜伏期的变化，探讨了AGE-RAGE通路激活、氧化应激和内皮功能的损伤在糖尿病脑病发病机制中的作用，以及缬沙坦对糖尿病大鼠脑组织AGE-RAGE通路、氧化应激和内皮损伤的影响，阐明缬沙坦对糖尿病脑病的保护机制，为临床糖尿病脑病的防治提供理论依据。
