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摘要
目的:构建含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因组逆转录病毒载体,同时进行逆转录病毒载体的包装,为进一步产生含恩替卡位耐药基因的假病毒,进一步感染肝源性细胞,进行耐药机制的研究做准备。方法:采用基因扩增、重组和克隆的方法,从构建好的含恩替卡位耐药基因的重组质粒中,扩增出含恩替卡位耐药基因的HBV全基因组,然后插到pLEGFP-N1载体上,再进行重组质粒的转化、提取、纯化和测序,然后将测序成功的重组质粒扩大培养,并转染PT67细胞,最后通过荧光倒置显微镜观察和提取细胞培养上清进行病毒DNA提取。结果:凝胶电泳分析血清HBVDNA扩增可见3.2kb条带,HBVDNA和pLEGFP-N1载体连接后可见10.1kb目的条带,该重组质粒双酶切后可见3.2kb和6.9kb目的条带。突变前质粒测序显示含有HBV基因型为C型血清型adr的全基因组,突变后测序证实存在HBV逆转录酶169、184、202、250位点的预期碱基突变。荧光倒置显微镜显示,转染后的PT67细胞有明显的荧光表达,培养上清DNA提取后,经过核酸分析仪检测,最后换算结果显示培养上清假病毒颗粒可达104-105/cfu。结论:成功构建了含恩替卡韦耐药基因的HBV全基因重组质粒,并进行了包装,产生了含恩替卡位耐药基因的假病毒颗粒。
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