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摘要
目的观察热打击后小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)和肺组织中肽基-脯氨酰顺/反异构酶1(Pin1)通过调控氧化应激和凋亡形成, 参与重症中暑急性肺损伤(acute lung injury, ALI)形成的分子机制。方法体外实验, 建立PMVECs热打击模型, 对照组将PMVECs置于标准37 ℃、5% CO2细胞培养箱, 热打击组将细胞置于43 ℃细胞培养箱中进行热打击2 h, 热打击后继续在细胞培养箱进行复温(1、3、6、12 h), 并使用Pin1抑制剂Juglone(1 μmol/L)预处理细胞1 h。体内实验, 通过热打击构建重症中暑小鼠模型, 热打击组动物置于仿真气候舱内, 舱内温度(35.5±0.5) ℃, 湿度(60±5)%, 肛温表监测小鼠直肠温度, 小鼠体温达到42 ℃即停止热打击, 热打击后1、3、6以及12 h处死动物, 对照组小鼠始终置于室温(25±0.5) ℃下, 并使用Pin1抑制剂Juglone (1 mg/kg)于热打击前连续3 d腹腔注射对小鼠进行预处理。Western blot观察Pin1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达情况;DHE染色, 荧光显微镜下观察细胞中O2-˙水平;ELISA检测肺组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平;HE染色检测各组小鼠的病理改变情况;免疫组化染色检测各组小鼠肺组织中Pin1表达情况;TUNEL染色检测各组小鼠肺组织凋亡情况。结果热打击后复温1 h即可诱导PMVECs和肺组织中Pin1的表达, 并呈现复温时间依赖性增加(F=771.6, P<0.05;F=1 035, P<0.05);热打击后复温3 h开始PMVECs和肺组织中cleaved caspase-9的表达, 并呈现复温时间依赖性增加(F=729.8, P<0.05;F=1 773, P<0.05);PMVECs和肺组织中cleaved caspase-3在热打击后复温3 h开始表达, 随着复温时间的延长其表达不断增多, 趋势与cleaved caspase-9一致(F=1 084, P<0.05;F=1 252, P<0.05);同时, 热打击后导致PMVECs中O2-˙释放。热打击后小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统失衡, 表现为热打击后小鼠肺组织中MDA的持续释放(F=114.2, P<0.05), 而SOD水平持续抑制(F=99.15, P<0.05)。使用Pin1抑制剂Juglone对PMVECs和小鼠进行预处理, 发现与热打击组相比, 热打击+Juglone组PMVECs和肺组织中Pin1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3均被抑制(均P<0.05);使用Pin1抑制剂后明显减轻热打击后PMVECs中O2-˙的释放, 促进重症中暑小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统平衡恢复, 与热打击组相比, 热打击+Juglone组肺组织中MDA被抑制[(11.53±0.84)nmol/mLvs (9.65±0.69) nmol/mL, t=12.52, P<0.05], 而SOD明显恢复[(41.18±3.45) U/mLvs (57.52±4.83) U/mL, t=5.57, P<0.05]。同时, 抑制Pin1表达后可以明显减轻热打击后肺组织的病理损伤, 以及抑制凋亡的发生。结论初步确认Pin1主要通过介导肺组织和PMVECs的氧化应激反应和凋亡发生, 进而参与热打击后肺损伤的形成。
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单位中国人民解放军南部战区总医院; 南方医科大学第三附属医院
