Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除载体的构建

作者：李敏英; 黄欢; 李倩; 骆明芬; 王晓悦; 刘红芳; 曾维英; 席丽艳

来源：中国真菌学杂志, 2021, 16(05): 303-307+313.

DOI：10.3969/j.issn.1673-3827.2021.05.003

• Fonsecaea monophora
• 聚酮合酶基因
• CRISPR-Cas9
• 载体构建

目的改造pFC332质粒,简化实验流程,构建Fonsecaea monophora PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除载体。方法设计引物PCR扩增pFC334质粒上的gRNA骨架,获得已经插入AarⅠ酶切位点的gRNA骨架片段后,使用PstI和MerI酶线性化pFC334载体,构建pFC334-AarⅠ载体,使用MreⅠ和BglⅡ酶对其和pFC332质粒进行双酶切,连接后获得pFC332-gRNA-AarⅠ载体,设计gRNA,最后将各片段插入到载体中。结果测序得到16533bp大小的改造后的pFC332-gRNA-AarⅠ质粒,构建了PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除载体,通过PCR,酶切以及测序的方法确定敲除载体构建成功。结论成功构建Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除载体,为研究PKS1基因及DHN-黑素在Fonsecaea monophora的生物学功能奠定了良好的基础。

• 单位
  中山大学孙逸仙纪念医院; 南方医科大学皮肤病医院