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摘要
【目的】探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物(miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics)、抑制物(miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor)、阴性对照(NC)及其靶基因的干扰siRNA(Gene-siRNA),转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶(GPD2)和环腺苷酸反应元件(CREB1);GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<-87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性(P<0.01),但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞(0 d)相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高(P<0.05),到第6天达到极显著差异(P<0.01);miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高(P<0.01)。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升(P<0.01),inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降(P<0.01);mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降(P<0.01),inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升(P<0.01);mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升(P<0.05;P<0.01),inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降(P<0.05);油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3′-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。
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单位四川农业大学; 动物科技学院; 四川省畜牧科学研究院
