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摘要
目的探讨自噬对脓毒症小鼠中性粒细胞程序性死亡配体-1(PD-L1)表达的影响及其作用机制。方法①体内实验:将6～8周龄雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、盲肠结扎穿孔术(CLP)组和雷帕霉素(RAP)+CLP组,每组10只。采用CLP模拟脓毒症模型;Sham组不结扎盲肠及穿孔,其他操作同CLP组。RAP+CLP组小鼠于制模前7 d腹腔注射自噬激动剂RAP 4 mg·kg-1·d-1;Sham组和CLP组不予任何处理。各组于术后4 d留取肺脏、肝脏、脾脏和胰腺组织进行免疫组化染色,光镜下观察各器官中性粒细胞的浸润情况;通过免疫荧光染色检测术后1 d、4 d小鼠肺脏中性粒细胞免疫抑制分子PD-L1和自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3 (LC3)的表达。②体外实验:提取和重悬小鼠骨髓中性粒细胞至1×1010/L,分为空白对照组(不给予任何处理)、RAP对照组(RAP 100 μmol/L)、自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf)对照组(Baf 10 μmol/L)、脂多糖(LPS)刺激组(LPS 1 mg/L)、RAP+LPS组、Baf+LPS组,后两组分别于LPS刺激前30 min给予100 μmol/L RAP或10 μmol/L Baf预处理。于LPS刺激0、4、12 h用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测中性粒细胞PD-L1 mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测PD-L1、LC3和自噬相关蛋白p62的蛋白表达。结果①体内实验:免疫组化显示CLP术后4 d小鼠肺脏、肝脏、脾脏和胰腺组织中均有大量中性粒细胞浸润;免疫荧光显示,随CLP术后时间延长,小鼠肺脏中性粒细胞LC3阳性表达呈降低趋势,而PD-L1的表达大幅度升高;给予RAP预处理可以促进CLP小鼠LC3的表达,同时抑制PD-L1的表达。②体外实验:在mRNA水平上,随LPS刺激时间延长,小鼠中性粒细胞PD-L1 mRNA表达均呈持续升高趋势,12 h达峰值,且明显高于空白对照组(2-ΔΔCT:72.2±10.0比13.0±0.8,P<0.01);给予自噬抑制剂RAP预处理后,PD-L1的mRNA表达较LPS刺激组明显降低(2-ΔΔCT:12 h为47.4±7.3比72.2±10.0,P<0.01);而给予自噬激动剂Baf预处理后,PD-L1的mRNA表达则较LPS刺激组明显升高(2-ΔΔCT:12 h为109.1±7.4比72.2±10.0,P<0.01)。在蛋白水平上,LPS刺激中性粒细胞后4 h,PD-L1、LC3及p62阳性表达较空白对照组显著增加,且PD-L1和p62随时间延长呈持续增加趋势;当使用RAP预处理后,PD-L1和p62阳性表达明显减少,而LC3表达进一步增加,说明自噬水平增加,自噬流通畅;与此相反,当使用Baf预处理后,PD-L1、LC3及p62表达均显著增加,说明自噬体与溶酶体的结合受阻,自噬流不畅。结论脓毒症时中性粒细胞在各个器官的浸润增加,肺脏中性粒细胞PD-L1表达明显增加,而自噬水平有所下降;LPS刺激下的中性粒细胞PD-L1表达可以被自噬激动剂所抑制,被自噬抑制剂所促进;PD-L1对脓毒症具有负向调控作用,可以通过靶向促进自噬来抑制脓毒症时PD-L1的表达,从而改善脓毒症。
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单位南京医科大学; 江苏大学附属医院
