微小RNA-325对肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤后凋亡的影响

作者：张左; 赵胜; 周向军; 宁金卓; 余伟民; 程帆^*

来源：中华实验外科杂志, 2021, 38(04): 692-695.

• 微小RNA
• 凋亡
• 缺氧复氧

目的探讨微小RNA-325(miRNA-325)在肾小管上皮细胞缺氧复氧(H/R)损伤模型中的作用及其机制。方法选取人肾小管上皮细胞HK-2,建立适当的肾小管上皮细胞H/R模型(缺氧24 h复氧2 h)。将HK-2细胞分为对照组、H/R组、H/R+抑制剂(inhibitor)组和H/R+抑制剂阴性对照(inNC),转染miRNA-325 inhibitor和inNC后进行缺氧复氧处理,然后进行后续实验。用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。利用蛋白质印迹法(Western blot)检测HK2细胞在H/R后活化半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)和X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)等的表达水平。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测HK2细胞中miRNA-325、Caspase-3和XIAP mRNA表达水平。使用双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-325与XIAP 3’端非编码区(3’UTR)之间的关系。组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果 H/R组细胞凋亡率高于对照组[(12.11±1.65)%比(3.88±0.24)%,t=8.311,P<0.05];H/R+Inhibitor组细胞凋亡率低于H/R组[(7.60±3.07)%比(12.11±1.65)%,t=4.557,P<0.05]。Western blot结果显示,实验组Cleaved Caspase-3[(0.50±0.02)、(0.63±0.01)、(0.61±0.02)比(0.41±0.01),F=212.095,P<0.05]和bax[(0.53±0.02)、(0.63±0.01)、(0.64±0.04)比(0.41±0.02),F=105.138,P<0.05]蛋白表达量显著高于对照组,bcl-2[(0.57±0.02)、(0.52±0.02)、(0.49±0.01)比(0.62±0.02),F=89.498,P<0.05]和XIAP[(0.29±0.01)、(0.24±0.03)、(0.24±0.01)比(0.33±0.03),F=27.575,P<0.05]表达量显著低于对照组;H/R+Inhibitor组Cleaved Caspase-3[(0.50±0.02)比(0.61±0.02),t=11.437,P<0.05]和bax[(0.53±0.02)比(0.64±0.04),t=7.253,P<0.05]的表达低于H/R组,bcl-2[(0.57±0.02)比(0.49±0.01),t=9.471,P<0.05]和XIAP[(0.29±0.01)比(0.24±0.01),t=4.231,P<0.05]的表达量高于H/R组,差异均有统计学意义。qRT-PCR结果显示,实验组miRNA-325[(7.27±0.30)、(4.66±0.21)、(7.11±0.25)比(1.05±0.13),F=1453.045,P<0.05]和Caspase-3 mRNA[(1.52±0.05)、(1.26±0.06)、(1.53±0.05)比(1.00±0.01),F=241.375,P<0.05]表达水平显著高于对照组,而XIAP mRNA[(0.38±0.01)、(0.76±0.02)、(0.39±0.02)比(1.01±0.02),F=2569.583,P<0.05]表达低于对照组;H/R+Inhibitor组miRNA-325[(4.66±0.21)比(7.27±0.30),t=24.236,P<0.05]和Caspase-3 mRNA[(1.26±0.06)比(1.52±0.05),t=11.451,P<0.05]低于H/R组,而XIAP mRNA[(0.76±0.02)比(0.38±0.01),t=45.678,P<0.05]高于H/R组,差异均有统计学意义。荧光素酶活性检测表明共转染miRNA-325的野生型组酶活性低于对照组[(0.69±0.03)比(1.01±0.02),t=22.809,P<0.05],而突变型组酶活性无明显变化[(1.04±0.11)比(0.99±0.06),t=0.983,P>0.05]。结论 XIAP是miRNA-325的靶基因之一,抑制miRNA-325可以下调凋亡蛋白的表达,降低细胞凋亡率,从而保护肾小管上皮细胞。

• 单位
  武汉大学人民医院