重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

作者：安柏霖; 苏璇; 郭悦; 王祥喜; 葛以跃; 朱凤才; 崔仑标^*

来源：中国食品卫生杂志, 2023, 35(03): 381-389.

DOI：10.13590/j.cjfh.2023.03.010

• 重组酶介导的等温扩增技术
• CRISPR-Cas13a
• 腹泻病原菌
• 快速分子检测

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7 4种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法 设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果 RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论 RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测。

• 单位
  中国科学院生物物理所; 南京医科大学; 南开大学; 江苏省疾病预防控制中心; 天津国际生物医药联合研究院