永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

作者：唐青海; 刘博; 谢金文; 魏凤; 谷英华; 高翠翠; 曹宗喜; 张艳^*; 王文秀^*

来源：西北农林科技大学学报(自然科学版), 2024, (02): 1-10.

DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2024.02.003

• 猪视网膜色素上皮细胞
• 永生化
• 猪流行性腹泻病毒
• 猪圆环病毒2型
• 猪伪狂犬病毒

[目的]建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。[方法]合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV) CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2) DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV) Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。[结果]PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为105.25TCID50/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(108.125 TCID50/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为106.125TCID50/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0TCID50/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为108.75 TCID50/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID50/mL)。[结论]成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。

• 单位
  山东省滨州畜牧兽医研究院; 生命科学学院; 衡阳师范学院; 海南省农业科学院畜牧兽医研究所