CRISPR/Cas9技术敲除RAW264.7细胞的GPR43基因抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能

作者：徐方明; 苏丛; 伍婷; 陈昊然; 张鹏飞; 刘艳艳; 兰燕虎^*; 李家斌^*

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2020, 36(06): 481-486.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.008979

• RAW264.7细胞
• 成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)
• G蛋白偶联受体43(GPR43)
• 肺炎克雷伯

目的利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)技术构建稳定敲除G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的RAW264.7细胞系,探究GPR43基因在肺炎克雷伯菌感染过程中的作用机制。方法设计3对针对GPR43基因的小导向RNA(sgRNA),将sgRNA插入pLenticrisprV2质粒中,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pLenticrisprV2;将病毒感染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序GPR43基因相关序列并与野生型GPR43基因进行比对,确认敲除成功的细胞株(GPR43-/- RAW264.7细胞), Western blot法检测GPR43蛋白水平。肺炎克雷伯菌感染GPR43-/- RAW264.7细胞,实时定量PCR法检测细菌感染后细胞内白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平的变化,并观察敲除GPR43后, RAW264.7细胞吞噬能力的变化。结果挑选的单克隆细胞经Western blot验证GPR43蛋白不表达,并且DNA测序结果显示在sgRNA插入位置缺失34个碱基,证明成功敲除GPR43基因。GPR43-/- RAW264.7细胞感染肺炎克雷伯菌后,细胞中的IL-1β、 IL-6和TNF-α表达水平均低于对照组,且GPR43-/- RAW264.7细胞对肺炎克雷伯菌的吞噬能力降低。结论 CRISPR/Cas9技术敲除GPR43基因,抑制其对肺炎克雷伯菌的吞噬功能及炎性细胞因子的产生。

• 单位
  安徽医科大学第一附属医院; 安徽医科大学