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摘要
目的:通过观察苓桂术甘汤(LG)对体外阿尔茨海默病(AD)病理状态下血脑屏障模型的影响,探讨其对AD血脑屏障损伤后修复的具体机制。方法:将50只雄性SPF级大鼠,随机分为5组,分别灌胃7 d,2次/d,LG高、中、低剂量组以4.8,2.4,1.2 g·kg-1,西药组以盐酸多奈哌齐0.5 mg·kg-1,正常组以等体积生理盐水灌胃,末次灌胃1 h后经腹主动脉取含药血清;以细胞共培养法构建AD体外血脑屏障损伤模型,实验分为正常组,模型组,LG高、中、低剂量组和盐酸多奈哌齐组,模型组加入β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)100μL,终浓度为5μmol·L-1,LG高、中、低剂量组以及盐酸多奈哌齐组在模型组基础上分别加入10%含药血清。通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活率;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组血脑屏障相关骨架蛋白跨膜密蛋白-5(Claudin-5),外周支架蛋白-1(ZO-1),闭合蛋白(Occludin),基质金属蛋白酶-2(MMP-2),基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量变化;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和Western blot检测LG高、中、低剂量组血脑屏障不同时间点Aβ转运蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)和晚期糖基化终产物受体(RAGE)表达。结果:MTT结果分析显示,与正常组比较,模型组细胞存活率明显下降(P<0.05);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和LG高剂量组细胞存活率明显增强(P<0.05);Western blot结果分析显示,与正常组比较,模型组骨架蛋白显著下调,MMP-2,MMP-9蛋白明显上调(P<0.05);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和LG高剂量骨架蛋白含量明显上调(P<0.05),MMP-2,9水平明显下降(P<0.05);与模型组比较,仅LG中剂量组Claudin-5蛋白水平明显上调(P<0.05),MMP-2水平明显下调(P<0.05);ELISA结果分析显示,与正常组比较,模型组IL-1β,IL-6,TNF-α含量明显上调(P<0.05);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和LG高、中剂量组IL-1β,IL-6,TNF-α表达明显下调(P<0.05);PCR结果分析显示,与0 h比较,3 h时LRP-1表达明显上调,RAGE表达明显下调(P<0.05),6,12,24,36 h后LRP-1,RAGE表达逐渐和缓;Western blot结果分析显示,3 h时,与正常组比较,模型组LRP-1含量明显下调,RAGE含量明显上调(P<0.05);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组和LG高剂量组LRP-1含量显著上调,RAGE含量明显下调(P<0.05)。结论:LG对AD体外血脑屏障损伤具有修复作用,其机制可能与抑制炎症因子和MMP-2,MMP-9表达、促进骨架蛋白表达并调节转运蛋白平衡相关。
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