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摘要
目的验证邻苯二甲酸二乙酯可发挥免疫佐剂作用,适量的添加可提高华蟾素油剂抑制肝细胞癌活性以及免疫细胞亚群的应答水平。方法以高效液相色谱法比较华蟾素肠溶片与干蟾皮药材之间的化学成分差异,对华蟾素肠溶片较干蟾皮药材HPLC图谱中多出的一个色谱峰采取硅胶柱层析、Sephadex-LH20凝胶柱层析法进行分离纯化,并以液相串联质谱(LC-MS/MS)和核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)鉴定其化学结构。药代动力学实验以华蟾素片的油剂和水剂在给药剂量为600 mg/kg(临床折算剂量)的情况下,检测SD大鼠血浆中邻苯二甲酸二乙酯代谢产物邻苯二甲酸单乙酯的药时浓度和药代动力学参数;采用标准曲线法和外标法对华蟾素肠溶片整片、包衣层、素片中邻苯二甲酸二乙酯及蟾蜍噻咛的含量进行分析。药效学研究以鼠源肝癌Hepa1-6皮下移植瘤为模型,分别以玉米油、华蟾素肠溶整片油剂(533 mg/kg,临床折算剂量)、华蟾素素片油剂(320 mg/kg)、华蟾素肠溶片包衣层油剂(213 mg/kg)灌胃2次/d,共计21 d,测量4个实验组小鼠的肿瘤体积;并收集不同给药组小鼠的脾脏和肿瘤组织,应用流式细胞技术分析上述四组小鼠脾脏和肿瘤组织中CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)、PD1+CD8+T细胞分布情况。为了考察邻苯二甲酸二乙酯本身是否具有抑瘤作用以及油剂对抑瘤效果的影响,重新剥取不含有华蟾素成分的包衣层粉末及纯度99%邻苯二甲酸二乙酯,配制成包衣层水剂组和油剂组(213 mg/kg),邻苯二甲酸二乙酯油剂组(8 mg/kg),以鼠源肝癌Hepa1-6皮下移植瘤为模型,灌胃2次/d,共计21 d,测量3个实验组小鼠的肿瘤体积。结果经鉴定,华蟾素肠溶片较干蟾皮药材HPLC图谱中多出的色谱峰为邻苯二甲酸二乙酯,推测是包衣过程中作为增塑剂辅料被引入。邻苯二甲酸二乙酯在体内转化成邻苯二甲酸单乙酯,大鼠以华蟾素油剂口服给药可提高邻苯二甲酸单乙酯在血浆中的浓度,表明油剂给药可提高邻苯二甲酸二乙酯的生物利用度。经高效液相色谱定量分析,华蟾素肠溶片整片、包衣层、素片中邻苯二甲酸二乙酯的含量分别为1. 64%,2. 51%,0. 56%;蟾蜍噻咛的含量分别为0. 033%,0. 015%,0. 048%。小鼠接种Hepa1-6细胞成瘤后,给药21 d后测量不同给药组小鼠的肿瘤体积发现华蟾素肠溶片包衣层油剂的抑瘤效果显著高于其他实验组,并且无毒副作用。包衣层油剂的抑瘤率可达49. 2%,整片油剂的抑瘤率40. 2%,素片油剂为36. 2%;上述三者以油剂给药均可提高小鼠脾脏中CD8+T细胞比重。在肿瘤组织中包衣层油剂显著提高了CD8+T细胞的比重(t-test P <0. 05)。该结果表明肿瘤免疫T细胞被活化。同时华蟾素肠溶片包衣层油剂显著降低了小鼠脾脏及肿瘤组织中的骨髓来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)和调节性T细胞(Regulatory cells,简称Tregs)数量(t-test P <0. 05),可使肿瘤细胞免疫应答抑制得以解除,从而有利于抑制肿瘤生长。当邻苯二甲酸二乙酯单独以油剂使用时,肿瘤抑制率达到了32. 5%,不含华蟾素成分的包衣层(邻苯二甲酸二乙酯含量为1. 27%,蟾蜍噻咛含量为0. 001%)油剂抑瘤率为34. 9%,而水剂给药时抑瘤率仅为25. 8%;表明油剂较水剂更有利于邻苯二甲酸二乙酯发挥抑瘤作用。同时本研究显示当治疗靶点饱和后,抑瘤效果不再随邻苯二甲酸二乙酯给药剂量的增加而提高。结论邻苯二甲酸二乙酯作为增塑剂辅料添加至华蟾素肠溶片中。邻苯二甲酸二乙酯在体内可增强华蟾素激活肿瘤浸润CD8+T细胞,降低免疫抑制细胞MDSCs和Tregs作用,提高免疫细胞亚群应答水平;并且邻苯二甲酸二乙酯本身在体内具有抑瘤作用,玉米油提高其在体内的吸收,利于发挥药效作用。所以将邻苯二甲酸二乙酯适量加入制剂处方中可提高华蟾素油剂的抑瘤作用。
