单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物被膜与消毒剂抗力分析

作者：尉小军; 李巧巧; 曾东东; 蒋建军^*

来源：中国畜牧兽医, 2022, 49(05): 1870-1878.

DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2022.05.027

• 单增李斯特菌
• inlK基因
• 生物被膜
• 消毒剂

【目的】研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系，以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考。【方法】以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌，根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365 inlK基因序列(登录号：AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物，以同源重组技术构建inlK基因缺失株，并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测。将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色，在倒置显微镜下观察形态变化，并用酶标仪测定生物被膜形成能力；用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂，含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂，设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组，进行中和剂的筛选，并检测不同浓度新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率。【结果】PCR结果表明，成功构建了缺失株Lm90SB2ΔinlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂，5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂。不同比例的新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2ΔinlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P<0.05;P<0.01),且在20 min时灭菌率均为100%。【结论】inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降，且对消毒剂抗力减弱。

• 单位
  动物科技学院; 石河子大学